Neutrofielen als prognostische factoren bij granulomatose met polyangiitis (voorheen Wegener-granulomatose genoemd) (NeutroVasc)

A - Specifieke doelstellingen Algemeen doel: Dit project is ontworpen om de fysiopathologische mechanismen die betrokken zijn bij GPA te bestuderen op cellulair en moleculair niveau. de onderzoekers willen neutrofielen bestuderen als prognostische factoren en de implicatie bepalen van PR3, het belangrijkste auto-antigeen in de resolutiefase van ontsteking.

de werkhypothese van de onderzoekers is dat structurele en functionele analyse van PR3 in neutrofielen de onderzoekers zal helpen zijn rol in GPA te ontrafelen. Daarom is ons langetermijndoel om de mechanismen die betrokken zijn bij de modulatie van PR3-expressie op het membraan van neutrofielen beter te begrijpen om hun activering te remmen en om nieuwe ontstekingsremmende therapeutische strategieën voor te stellen die zijn aangepast aan GPA.

Huidig ​​project: De onderzoekers hebben onlangs aangetoond dat in menselijke neutrofielen i) PR3 tot expressie kan worden gebracht op het membraan van neutrofielen tijdens apoptose in afwezigheid van degranulatie, ii) PR3 is een lid van een moleculaire scaffold bestaande uit fosfolipidenscramblase1 (scramblase) en calreticuline geëxternaliseerd tijdens apoptose , iii) apoptose-geïnduceerde PR3-membraanexpressie belemmert de herprogrammering van macrofagen na fagocytose van apoptotische neutrofielen. - antigene capaciteit.

De specifieke doelen zijn:

1. Karakterisering van apoptose in neutrofielen van GPA-patiënten
2. Analyse van PR3-partners (CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) of tot co-expressie gebracht eiwit dat van belang is bij ontsteking (AnnexinA1,) expressie in neutrofielen van patiënten met GPA in vergelijking met gezonde controles
3. Identificatie van nieuwe partners van PR3 in neutrofielen
4. Analyse van het proteoom van neutrofielen van GPA-patiënten

B. Achtergrond en betekenis 1.1. Inleiding GPA is een systemische vasculitis die voornamelijk wordt geassocieerd met anti-PR3 ANCA. De rol van geactiveerde neutrofielen bij vasculitislaesies wordt gesuggereerd door hun aanwezigheid in perivasculaire infiltraten, vooral in nierglomeruli en in de longen.

PR3 is een serineprotease die voor het eerst werd beschreven in azurofiele korrels van neutrofielen die NIET verondersteld worden te fuseren met het plasmamembraan, maar worden vrijgegeven in het fagolysosoom na fagocytose van de ziekteverwekker. We hebben voor het eerst aangetoond dat de subcellulaire lokalisatie van PR3 niet beperkt was tot azurofiele korrels, zoals eerder werd gedacht, maar dat PR3 gelokaliseerd was in secretoire blaasjes, een zeer mobiliseerbaar compartiment, wat de aanwezigheid van PR3 aan het oppervlak van rustende geïsoleerde cellen verklaart. neutrofielen. Bovendien kan een hoog percentage neutrofielen die PR3 tot expressie brengen, waargenomen bij patiënten met vasculitis, worden beschouwd als een risicofactor voor vasculitis. Deze hoge expressie van membraan-PR3 bij patiënten met GPA resulteerde in een toename van door ANCA geïnduceerde respiratoire burst in neutrofielen, waardoor het ontstekingsproces werd versterkt. In vitro veroorzaakt de binding van ANCA aan PR3 de respiratoire burst, degranulatie en het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines.

Omdat PR3-membraanexpressie een belangrijke pathofysiologische gebeurtenis is in GPA, aangezien het een voorwaarde is voor de daaropvolgende activering van neutrofielen door ANCA, hebben we geprobeerd mechanismen te bepalen die betrokken zijn bij PR3-membraanexpressie. In neutrofielen hebben we aangetoond dat apoptose een significant verhoogde PR3-expressie in het membraan veroorzaakte zonder degranulatie. In deze experimenten konden we MPO niet detecteren op het membraan van neutrofielen. Onze resultaten verschillen van eerder gerapporteerde gegevens die aantonen dat zowel MPO als PR3 werden geëxternaliseerd tijdens apoptose vanwege de translocatie van azurofiele korrels naar het plasmamembraan. Dit fenomeen lijkt op te treden wanneer neutrofielen late apoptose en secundaire necrose ondergaan, wat leidt tot expressie van alle granule-eiwitten op het celoppervlak.

Door apoptose geïnduceerde PR3-externalisatie zou van groot belang kunnen zijn in de pathofysiologie van GPA, omdat PR3, waarvan werd aangenomen dat het een intracellulair antigeen was, dus wordt blootgesteld aan het plasmamembraan van apoptotische cellen, waardoor het pro-inflammatoire potentieel, de immunogene eigenschappen en interfererende eigenschappen worden versterkt. met fagocytose van macrofagen. We hebben ook aangetoond dat PR3-expressie tijdens apoptose geassocieerd is met de expressie van calreticuline, een bekend "eet-me-signaal". We hebben eindelijk aangetoond dat de aanwezigheid van PR3 de herprogrammering van macrofagen tot een ontstekingsremmend profiel belemmert na fagocytose van apoptotische cellen via de CRT/LRP-route.

Er kan worden verondersteld dat de expressie van het complexe PR3 / scramblase / CRT en andere partners (CD11b, CD16) aan het oppervlak van apoptotische neutrofielen goede prognosemarkers zou kunnen vormen. Gene array-onderzoeken hebben gewezen op een deregulering van neutrofielen in GPA. We stellen de hypothese dat het proteoom van neutrofielen van GPA-patiënten zeer informatief zou zijn over de activeringsstatus en overlevingsstatus en dat het een biologische marker van klinische ernst zou kunnen zijn.

Het is dus relevant om de deregulering van neutrofielen tijdens hun hele levenscyclus te bestuderen: hun oxidatieve uitbarsting onder activering, hun fysiologische apoptose, de expressie van PR3-partners. Deze studie zal worden uitgevoerd in neutrofielen van patiënten met GPA in vergelijking met voor leeftijd en geslacht aangepaste gezonde controles.

C. Voorlopige studies Analyse van apoptose in neutrofielen van GPA-patiënten In de literatuur werd gevonden dat neutrofielen van patiënten met ANCA-geassocieerde vasculitis (AAV) een verstoorde TNFα-geïnduceerde apoptose hebben en een hogere apoptose hebben dan controles. Gepubliceerde gegevens over fysiologische apoptose, de spontane apoptose die neutrofielen ondergaan bij afwezigheid van exogene stimuli, zijn echter tegenstrijdig. Wanneer kalfsfoetaal serum in medium wordt toegevoegd, vertonen neutrofielen van GPA-patiënten een vergelijkbaar apoptosepercentage als controles. Wanneer het serum van patiënten wordt gebruikt, hebben neutrofielen van AAV-patiënten in remissie een hogere overlevingskans in vivo dan controles, en dit verschil verdwijnt wanneer normaal serum wordt gebruikt. Deze resultaten komen overeen met de ontdekking dat GPA-patiënten een hoge expressie van PCNA hebben, wat geassocieerd is met overleving. Daarom willen we de mate van apoptose van neutrofielen in GPA bestuderen bij diagnose, tijdens recidief en na remissie op volbloed. Deze resultaten zullen worden vergeleken met op leeftijd en geslacht afgestemde controles. Apoptose zal worden geëvalueerd door de fosfatidylserine-externalisatie gemeten door flowcytometrie na annexine-V-labeling en 7-AAD-kleuring op CD15+-cellen. PCNA-expressie zal ook worden onderzocht in de verschillende klinische stadia en er zal een proteomisch profiel van apoptotische neutrofielen worden uitgevoerd.

Analyse van scramblase/calreticuline-expressie in neutrofielen van GPA-patiënten In een cellulair model (RBL-cellijn) hebben we aangetoond dat scramblase-extinctie door shRNA geassocieerd was met een verminderde expressie van fosfatidylserine tijdens apoptose en dat door PR3-apoptose geïnduceerde expressie ook verstoord was (ongepubliceerd gegevens). We konden ook aantonen dat in vitro scramblase en PR3 fysiek op elkaar inwerken. Tijdens apoptose wordt PR3 ook geassocieerd met calreticuline op het membraan van neutrofielen. Deze gegevens suggereren dat de associatie PR3/Scramblase/Calreticulin een moleculair platform vormt dat een functioneel platform is dat de herkenningsroutes (zoals CRT/LRP) tussen macrofagen en apoptotische neutrofielen zou kunnen verstoren. De expressie van deze partners op het neutrofielmembraan tijdens apoptose zal worden onderzocht bij patiënten bij diagnose en wanneer remissie is verkregen.

Onderzoeksontwerp en methoden:

1. Karakterisatie van apoptose in neutrofielen van GPA-patiënten We zullen de apoptosesnelheid van neutrofielen in volbloed bepalen.

   Methodologie:

   Er zal onderzoek worden uitgevoerd op zowel neutrofielen die zijn geïsoleerd van gezonde controledonoren verkregen in het Franse Bloedinstituut (Etablissement Français du Sang) als van patiënten met vasculitis van de afdeling Interne Geneeskunde van het Cochin-ziekenhuis onder leiding van professor Loïc Guillevin.

   Apoptose zal "fysiologisch" worden geïnduceerd in volbloed door incubatie gedurende de nacht bij 37°C.

   De externalisatie van fosfatidylserine zal worden gemeten door middel van flowcytometrie na annexine-V-labeling geassocieerd met 7-AAD-kleuring voor CD15+-cellen.

   Western-blotanalyse met behulp van een specifiek antilichaam tegen PCNA zal ook worden gebruikt om de expressie ervan te visualiseren.

2. Analyse van scramblase, PR3, calreticuline, AnnexinA1, expressie in apoptotische neutrofielen van GPA-patiënten -), vroege apoptotische neutrofielen (AnnexinV+, 7AAD-) en late apoptotische neutrofielen (AnnexinV+, 7AAD+). Deze bepaling zal worden gedaan voor patiënten op het moment van diagnose (in actieve toestand; BVAS>3) en bij remissie.

   Methodologie

   • Neutrofielen zullen worden geïsoleerd uit bloed met behulp van dextran-gradiënt en Ficoll.
   • Onderzoek van PR3, CRT, PLSCR, AxA1, membraanexpressie zal worden gemeten op geïsoleerde neutrofielen door middel van flowcytometrie na incubatie gedurende de nacht bij 37°C met beoordeling van apoptose door middel van annexine-V-labeling en 7AAD-kleuring.

3. Studie van de respiratoire burst in neutrofielen van GPA-patiënten Een van de belangrijkste functies van neutrofielen is de productie van reactieve zuurstofsoorten. kralen door IgG, PMA) met of zonder voorafgaande priming door TNFα.

   Methodologie:

   Onderzoek van de respiratoire burst zal gebeuren in volbloed met een chemoluminescente (luminol) techniek. Neutrofielen worden geprimed door TNFα of gestimuleerd zonder priming. De burst-respons wordt gedurende 90 minuten na stimulatie geanalyseerd.

4. Deregulering van neutrofielen Cytokinome Neutrofielen zijn in staat om een ​​groot aantal cytokines (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), groeifactoren zoals GM-CSF en chimiokines zoals IL-8 te synthetiseren. Meer recent is aangetoond dat neutrofielen ook grote producenten zijn van BAFF (B-cel activerende factor) en dat de productie superieur is aan die door monocyten of dendritische cellen wanneer ze worden gestimuleerd door INF-γ. In GPA is aangetoond dat serum-BAFF-spiegels hoger zijn dan controles en onlangs hebben therapieën gericht op B-lymfocyten in grote gecontroleerde onderzoeken hun belang bij AAV bevestigd.

   Methodologie:

   Serum van patiënten zal tegelijkertijd worden verzameld dan neutrofielen. Ze zullen worden geanalyseerd met behulp van BD™ Cytometric Bead Array (CBA) met detectie van IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF en IL-12p70. Neutrofielen die zullen worden geïsoleerd zoals in 1) zullen worden gestimuleerd door INF-y, LPS en G-CSF om hun productie en uitscheiding van BAFF/BlyS bepaald door ELISA te analyseren.

5. Deregulering van neutrofielen Proteoom en functionele studie van nieuwe PR3-partners Gene array-studies hebben een waarschijnlijke deregulering van neutrofielen in AAV aangetoond, in deze studie zullen we deze deregulering op eiwitniveau bestuderen.

Methodologie:

Om het proteoom van GPA-patiënt te bestuderen wanneer deze actief en in remissie is in vergelijking met gezonde controles, zullen we een verschil in gelelektroforese gebruiken van cytosolische monsters van neutrofielen verkregen door sonicatie. Identificatie van interessante eiwitten zal gebeuren door massaspectrometrie MALDI-TOF-TOF. Functionele validatie van deze eiwitten door middel van overexpressie of siRNA-extinctie zal worden uitgevoerd.