Les neutrophiles comme facteurs pronostiques dans la granulomatose avec polyangéite (anciennement appelée granulomatose de Wegener) (NeutroVasc)

A - Objectifs spécifiques Objectif général : Ce projet vise à étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la GPA au niveau cellulaire et moléculaire. les chercheurs veulent étudier les neutrophiles comme facteurs pronostiques et déterminer l'implication de PR3, l'auto-antigène majeur dans la phase de résolution de l'inflammation.

l'hypothèse de travail des chercheurs est que l'analyse structurelle et fonctionnelle de PR3 dans les neutrophiles aidera les chercheurs à démêler son rôle dans la GPA. Ainsi, notre objectif à long terme est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la modulation de l'expression de PR3 au niveau de la membrane des neutrophiles afin d'inhiber leur activation et de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires adaptées au GPA.

Projet actuel : Les chercheurs ont récemment démontré que dans les neutrophiles humains i) PR3 peut être exprimé au niveau de la membrane des neutrophiles pendant l'apoptose en l'absence de dégranulation, ii) PR3 est un membre d'un échafaudage moléculaire comprenant la phospholipide scramblase1 (scramblase) et la calréticuline extériorisée pendant l'apoptose , iii) l'expression membranaire de PR3 induite par l'apoptose altère la reprogrammation des macrophages après la phagocytose des neutrophiles apoptotiques L'hypothèse des chercheurs est que PR3 pourrait avoir des partenaires moléculaires spécifiques qui peuvent faciliter son externalisation et/ou sa persistance à la membrane plasmique pendant l'apoptose des neutrophiles, potentialisant ainsi son auto -capacité antigénique.

Les objectifs spécifiques sont :

1. Caractérisation de l'apoptose chez les neutrophiles de patients GPA
2. Analyse des partenaires PR3 (CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) ou de la protéine co-exprimée d'intérêt dans l'inflammation (AnnexinA1,) expression dans les neutrophiles de patients atteints de GPA par rapport à des témoins sains
3. Identification de nouveaux partenaires de PR3 dans les neutrophiles
4. Analyse du protéome des neutrophiles de patients GPA

B. Contexte et importance 1.1. Introduction La GPA est une vascularite systémique principalement associée aux ANCA anti-PR3. Le rôle des neutrophiles activés dans les lésions de vascularite est suggéré par leur présence dans les infiltrats périvasculaires, en particulier dans les glomérules rénaux et dans le poumon.

PR3 est une sérine protéase décrite pour la première fois dans les granules azurophiles des neutrophiles qui ne sont PAS censés fusionner avec la membrane plasmique mais sont libérés dans le phagolysosome après la phagocytose de l'agent pathogène. Nous avons montré pour la première fois que la localisation subcellulaire de PR3 n'était pas limitée aux granules azurophiles, comme on le pensait auparavant, mais que PR3 était localisée dans les vésicules sécrétoires, un compartiment hautement mobilisable, expliquant ainsi la présence de PR3 à la surface de repos isolés. neutrophiles. De plus, un pourcentage élevé de neutrophiles exprimant PR3 observé chez les patients atteints de vascularite pourrait être considéré comme un facteur de risque de vascularite. Cette expression élevée de PR3 membranaire chez les patients atteints de GPA a entraîné une augmentation de la poussée respiratoire induite par les ANCA dans les neutrophiles, améliorant ainsi le processus inflammatoire. In vitro, la liaison d'ANCA à PR3 déclenche la poussée respiratoire, la dégranulation et la libération de cytokines pro-inflammatoires.

L'expression membranaire de PR3 étant un événement physiopathologique important dans la GPA puisqu'elle est une condition préalable à l'activation ultérieure des neutrophiles par les ANCA, nous avons cherché à déterminer les mécanismes impliqués dans l'expression membranaire de PR3. Chez les neutrophiles, nous avons démontré que l'apoptose déclenchait une expression significativement accrue de PR3 membranaire sans dégranulation. Dans ces expériences, nous n'avons pas réussi à détecter la MPO au niveau de la membrane des neutrophiles. Nos résultats diffèrent des données précédemment rapportées montrant que MPO et PR3 ont été extériorisés pendant l'apoptose en raison de la translocation des granules azurophiles vers la membrane plasmique. Ce phénomène semble se produire lorsque les neutrophiles subissent une apoptose tardive et une nécrose secondaire, conduisant à l'expression de toutes les protéines granulaires à la surface des cellules.

L'externalisation de PR3 induite par l'apoptose pourrait être d'une grande importance dans la physiopathologie de la GPA car PR3, qui était supposé être un antigène intracellulaire, est ainsi exposé au niveau de la membrane plasmique des cellules apoptotiques amplifiant ainsi son potentiel pro-inflammatoire, ses propriétés immunogènes et interférentes. avec phagocytose des macrophages. Nous avons également démontré qu'au cours de l'apoptose, l'expression de PR3 est associée à l'expression de la calréticuline, un "signal mange-moi" bien connu. Nous avons enfin mis en évidence que la présence de PR3 altère la reprogrammation des macrophages vers un profil anti-inflammatoire après phagocytose des cellules apoptotiques par la voie CRT/LRP.

On peut émettre l'hypothèse que l'expression du complexe PR3/scramblase/CRT et d'autres partenaires (CD11b, CD16) à la surface des neutrophiles apoptotiques pourrait constituer de bons marqueurs de pronostic. Nous faisons l'hypothèse que le protéome des neutrophiles des patients GPA serait très informatif sur son état d'activation, son état de survie et qu'il pourrait être un marqueur biologique de sévérité clinique.

Il est donc pertinent d'étudier la dérégulation des neutrophiles au cours de leur cycle de vie : leur bouffée oxydative sous activation, leur apoptose physiologique, l'expression des partenaires PR3. Cette étude sera réalisée sur des neutrophiles de patients atteints de GPA par rapport à des témoins sains ajustés en fonction de l'âge et du sexe.

C. Études préliminaires Analyse de l'apoptose chez les neutrophiles de patients GPA Dans la littérature, les neutrophiles de patients atteints de vascularite associée aux ANCA (VAA) se sont avérés avoir une apoptose induite par le TNFα perturbée et ont tendance à avoir un taux d'apoptose plus élevé que les témoins. Cependant, les données publiées sur l'apoptose physiologique qui est l'apoptose spontanée que subissent les neutrophiles en l'absence de stimuli exogènes sont contradictoires. Lorsque du sérum fœtal de veau est ajouté au milieu, les neutrophiles des patients GPA affichent un taux d'apoptose similaire à celui des témoins. Lorsque le sérum des patients est utilisé, les neutrophiles des patients AAV en rémission ont un taux de survie in vivo plus élevé que les témoins, et cette différence disparaît lorsque le sérum normal est utilisé. Ces résultats sont en accord avec la découverte que les patients GPA ont une expression élevée de PCNA qui est associée à la survie. Par conséquent, nous voulons étudier le taux d'apoptose des neutrophiles dans GPA au diagnostic, pendant la rechute et après la rémission sur sang total. Ces résultats seront comparés à des témoins appariés selon l'âge et le sexe. L'apoptose sera évaluée par l'externalisation de la phosphatidylsérine mesurée par cytométrie en flux après marquage à l'annexine-V et coloration au 7-AAD sur des cellules CD15+. L'expression de PCNA sera également étudiée à différents stades cliniques et le profil protéomique des neutrophiles apoptotiques sera réalisé.

Analyse de l'expression de la scramblase/calréticuline dans les neutrophiles de patients GPA Dans un modèle cellulaire (lignée cellulaire RBL), nous avons démontré que l'extinction de la scramblase par le shRNA était associée à une diminution de l'expression de la phosphatidylsérine au cours de l'apoptose et que l'expression induite par l'apoptose PR3 était également altérée (non publié Les données). Nous avons également pu démontrer que la scramblase in vitro et la PR3 interagissent physiquement. Au cours de l'apoptose, PR3 est également associé à la calréticuline au niveau de la membrane des neutrophiles. Ces données suggèrent que l'association PR3/Scramblase/Calreticuline forme un échafaudage moléculaire qui est une plate-forme fonctionnelle qui pourrait interférer avec les voies de reconnaissance (comme CRT/LRP) entre les macrophages et les neutrophiles apoptotiques. L'expression de ces partenaires au niveau de la membrane des neutrophiles lors de l'apoptose sera étudiée chez des patients au moment du diagnostic et lorsque la rémission est obtenue.

Conception et méthodes de recherche :

1. Caractérisation de l'apoptose chez les neutrophiles de patients GPA Nous déterminerons le taux d'apoptose des neutrophiles dans le sang total.

   Méthodologie:

   Les recherches porteront à la fois sur des neutrophiles isolés de donneurs témoins sains obtenus à l'Etablissement Français du Sang et sur des patients atteints de vascularite du Service de Médecine Interne de l'Hôpital Cochin dirigé par le Professeur Loïc Guillevin.

   L'apoptose sera induite "physiologiquement" dans le sang total par une nuit d'incubation à 37°C.

   L'externalisation de la phosphatidylsérine sera mesurée par cytométrie en flux après marquage à l'annexine-V associé à une coloration au 7-AAD pour les cellules CD15+.

   Une analyse Western blot utilisant un anticorps spécifique contre PCNA sera également utilisée pour visualiser son expression.

2. Analyse de la scramblase, PR3, calréticuline, AnnexinA1, expression dans les neutrophiles apoptotiques des patients GPA -), les neutrophiles apoptotiques précoces (AnnexinV+, 7AAD-) et les neutrophiles apoptotiques tardifs (AnnexinV+, 7AAD+). Cette détermination sera faite pour les patients au moment du diagnostic (en état actif ; BVAS>3) et en rémission.

   Méthodologie

   • Les neutrophiles seront isolés du sang à l'aide d'un gradient de Dextran et de Ficoll.
   • L'étude de PR3, CRT, PLSCR, AxA1, l'expression membranaire sera mesurée sur des neutrophiles isolés par cytométrie en flux après une nuit d'incubation à 37 ° C avec évaluation de l'apoptose par marquage à l'annexine-V et coloration au 7AAD.

3. Etude de la bouffée respiratoire chez les neutrophiles des patients GPA Une des principales fonctions des neutrophiles est la production d'espèces réactives de l'oxygène, nous déterminerons le métabolisme oxydatif des neutrophiles dû à différents stimuli (f-MLP, billes de zymosan opsonisées par complément, zymosan opsonisé billes par IgG, PMA) avec ou sans amorçage préalable par TNFα.

   Méthodologie:

   L'exploration de la bouffée respiratoire se fera en sang total avec une technique chimioluminescente (luminol). Les neutrophiles seront amorcés par le TNFα ou stimulés sans amorçage. La réponse en rafale sera analysée pendant 90 minutes après la stimulation.

4. Dérégulation des neutrophiles Cytokinome Les neutrophiles sont capables de synthétiser un grand nombre de cytokines (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), de facteurs de croissance comme le GM-CSF et de chimiokines comme l'IL-8. Plus récemment, il a été montré que les neutrophiles sont également de grands producteurs de BAFF (B-cell activating factor) et que la production est supérieure à celles des monocytes ou des cellules dendritiques lorsqu'elles sont stimulées par l'INF-γ. Dans le GPA, les taux de BAFF sériques se sont avérés plus élevés que les témoins et, récemment, les thérapeutiques ciblant les lymphocytes B ont confirmé dans de vastes essais contrôlés leur importance dans l'AAV.

   Méthodologie:

   Le sérum des patients sera prélevé en même temps que les neutrophiles. Ils seront analysés à l'aide du BD™ Cytometric Bead Array (CBA) avec détection de l'IL-8, de l'IL-1β, de l'IL-6, de l'IL-10, du TNF et de l'IL-12p70. Les neutrophiles qui seront isolés comme en 1) seront stimulés par INF-γ, LPS et G-CSF pour analyser leur production et sécrétion de BAFF/BlyS déterminée par ELISA.

5. Dérégulation des neutrophiles Protéome et étude fonctionnelle de nouveaux partenaires PR3 Des études de puces à gènes ont montré une probable dérégulation des neutrophiles chez les AAV, dans cette étude nous étudierons cette dérégulation au niveau protéique.

Méthodologie:

Pour étudier le protéome du patient GPA lorsqu'il est actif et en rémission par rapport aux témoins sains, nous utiliserons un différentiel en électrophorèse sur gel d'échantillons cytosoliques de neutrophiles obtenus par sonication. L'identification des protéines d'intérêt se fera par spectrométrie de masse MALDI-TOF-TOF. Une validation fonctionnelle de ces protéines par surexpression ou extinction de siARN sera effectuée.