Neutrofili come fattori prognostici nella granulomatosi con poliangioite (precedentemente denominata granulomatosi di Wegener) (NeutroVasc)

A - Obiettivi specifici Obiettivo generale: Questo progetto ha lo scopo di studiare i meccanismi fisiopatologici coinvolti nella GPA a livello cellulare e molecolare. i ricercatori vogliono studiare i neutrofili come fattori prognostici e determinare l'implicazione del PR3, il principale autoantigene nella fase di risoluzione dell'infiammazione.

l'ipotesi di lavoro degli investigatori è che l'analisi strutturale e funzionale del PR3 nei neutrofili aiuterà gli investigatori a svelare il suo ruolo nella GPA. Pertanto, il nostro obiettivo a lungo termine è comprendere meglio i meccanismi coinvolti nella modulazione dell'espressione di PR3 sulla membrana dei neutrofili al fine di inibire la loro attivazione e proporre nuove strategie terapeutiche antinfiammatorie adattate alla GPA.

Progetto attuale: i ricercatori hanno recentemente dimostrato che nei neutrofili umani i) PR3 può essere espresso sulla membrana dei neutrofili durante l'apoptosi in assenza di degranulazione, ii) PR3 è un membro di un'impalcatura molecolare comprendente fosfolipidi scramblase1 (scramblase) e calreticulina esternalizzata durante l'apoptosi , iii) l'espressione della membrana PR3 indotta dall'apoptosi compromette la riprogrammazione dei macrofagi dopo la fagocitosi dei neutrofili apoptotici L'ipotesi dei ricercatori è che PR3 potrebbe avere partner molecolari specifici che possono facilitare la sua esternalizzazione e/o la sua persistenza sulla membrana plasmatica durante l'apoptosi dei neutrofili potenziando così la sua auto -capacità antigenica.

Le finalità specifiche sono:

1. Caratterizzazione dell'apoptosi nei neutrofili di pazienti affetti da GPA
2. Analisi dei partner PR3 (CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) o della proteina co-espressa di interesse nell'infiammazione (AnnexinA1,) espressione nei neutrofili di pazienti con GPA rispetto ai controlli sani
3. Identificazione di nuovi partner di PR3 nei neutrofili
4. Analisi del proteoma dei neutrofili da pazienti GPA

B. Contesto e significato 1.1. Introduzione La GPA è una vasculite sistemica che è principalmente associata ad ANCA anti-PR3. Il ruolo dei neutrofili attivati ​​nelle lesioni vasculitiche è suggerito dalla loro presenza negli infiltrati perivascolari, specialmente nei glomeruli renali e nel polmone.

PR3 è una serina proteasi descritta per la prima volta all'interno di granuli azzurrofili di neutrofili che NON dovrebbero fondersi con la membrana plasmatica ma vengono rilasciati all'interno del fagolisosoma dopo la fagocitosi del patogeno. Abbiamo dimostrato per la prima volta che la localizzazione subcellulare di PR3 non era ristretta ai granuli azzurrofili, come si pensava in precedenza, ma che PR3 era localizzata in vescicole secretorie, un compartimento altamente mobilizzabile, spiegando così la presenza di PR3 sulla superficie di cellule isolate a riposo. neutrofili. Inoltre, un'alta percentuale di neutrofili che esprimono PR3 osservata nei pazienti con vasculite potrebbe essere considerata un fattore di rischio per la vasculite. Questa elevata espressione della membrana PR3 nei pazienti con GPA ha provocato un aumento del burst respiratorio indotto da ANCA nei neutrofili, migliorando così il processo infiammatorio. In vitro il legame di ANCA a PR3 innesca il burst respiratorio, la degranulazione e il rilascio di citochine pro-infiammatorie.

Poiché l'espressione della membrana PR3 è un importante evento fisiopatologico nella GPA poiché è un prerequisito per la successiva attivazione dei neutrofili da parte dell'ANCA, abbiamo cercato di determinare i meccanismi coinvolti nell'espressione della membrana PR3. Nei neutrofili, abbiamo dimostrato che l'apoptosi ha innescato un'espressione PR3 di membrana significativamente aumentata senza degranulazione. In questi esperimenti, non siamo riusciti a rilevare MPO sulla membrana dei neutrofili. I nostri risultati differiscono dai dati precedentemente riportati che mostrano che sia MPO che PR3 sono stati esternalizzati durante l'apoptosi a causa della traslocazione dei granuli azzurrofili alla membrana plasmatica. Questo fenomeno sembra verificarsi quando i neutrofili subiscono l'apoptosi tardiva e la necrosi secondaria, portando all'espressione di tutte le proteine ​​dei granuli sulla superficie cellulare.

L'esternalizzazione del PR3 indotta dall'apoptosi potrebbe essere di grande rilevanza nella fisiopatologia della GPA perché il PR3, che si supponeva essere un antigene intracellulare, è quindi esposto alla membrana plasmatica delle cellule apoptotiche amplificando così il suo potenziale pro-infiammatorio, le sue proprietà immunogeniche e interferenti con fagocitosi dei macrofagi. Abbiamo anche dimostrato che durante l'apoptosi l'espressione di PR3 è associata all'espressione di calreticulina, un noto "segnale mangiami". Abbiamo infine evidenziato che la presenza di PR3 compromette la riprogrammazione dei macrofagi ad un profilo antinfiammatorio dopo la fagocitosi delle cellule apoptotiche attraverso la via CRT/LRP.

Si può ipotizzare che l'espressione del complesso PR3/scramblase/CRT e altri partner (CD11b, CD16) sulla superficie dei neutrofili apoptotici possa costituire un buon marker di prognosi. Studi di gene array hanno evidenziato una deregolazione dei neutrofili nella GPA. Facciamo l'ipotesi che il proteoma dei neutrofili dei pazienti con GPA sarebbe molto informativo sul suo stato di attivazione, stato di sopravvivenza e che potrebbe essere un marker biologico di gravità clinica.

È quindi pertinente studiare la deregolazione dei neutrofili durante tutto il loro ciclo di vita: il loro burst ossidativo sotto attivazione, la loro apoptosi fisiologica, l'espressione dei partner PR3. Questo studio verrà eseguito nei neutrofili di pazienti con GPA rispetto a controlli sani aggiustati per età e sesso.

C. Studi preliminari Analisi dell'apoptosi nei neutrofili di pazienti affetti da GPA In letteratura, i neutrofili di pazienti con vasculite associata ad ANCA (AAV) presentano un'apoptosi indotta da TNFα disturbata e tendono ad avere un tasso di apoptosi più elevato rispetto ai controlli. Tuttavia, i dati pubblicati sull'apoptosi fisiologica, che è l'apoptosi spontanea che i neutrofili subiscono in assenza di stimoli esogeni, sono contraddittori. Quando il siero fetale di vitello viene aggiunto nel mezzo, i neutrofili dei pazienti con GPA mostrano un tasso di apoptosi simile a quello dei controlli. Quando viene utilizzato il siero dei pazienti, i neutrofili dei pazienti AAV in remissione hanno un tasso di sopravvivenza più elevato in vivo rispetto ai controlli e questa differenza scompare quando viene utilizzato il siero normale. Questi risultati sono in accordo con la scoperta che i pazienti GPA hanno un'alta espressione di PCNA che è associata alla sopravvivenza. Pertanto, vogliamo studiare il tasso di apoptosi dei neutrofili nella GPA alla diagnosi, durante la recidiva e dopo la remissione su sangue intero. Questi risultati saranno confrontati con controlli appaiati per età e sesso. L'apoptosi sarà valutata mediante l'esternalizzazione della fosfatidilserina misurata mediante citometria a flusso dopo marcatura con annessina-V e colorazione con 7-AAD su cellule CD15+. Verrà anche studiata l'espressione di PCNA nei diversi stadi clinici e sarà analizzato il profilo proteomico dei neutrofili apoptotici.

Analisi dell'espressione di scramblase/calreticulina nei neutrofili di pazienti con GPA In un modello cellulare (linea cellulare RBL), abbiamo dimostrato che l'estinzione di scramblase da parte di shRNA era associata a una ridotta espressione di fosfatidilserina durante l'apoptosi e che anche l'espressione indotta dall'apoptosi di PR3 era compromessa (non pubblicato dati). Siamo stati anche in grado di dimostrare che scramblase in vitro e PR3 interagiscono fisicamente. Durante l'apoptosi, PR3 è anche associato alla calreticulina sulla membrana dei neutrofili. Questi dati suggeriscono che l'associazione PR3/Scramblase/Calreticulin forma un'impalcatura molecolare che è una piattaforma funzionale che potrebbe interferire con le vie di riconoscimento (come CRT/LRP) tra macrofagi e neutrofili apoptotici. L'espressione di questi partner sulla membrana dei neutrofili durante l'apoptosi sarà studiata nei pazienti alla diagnosi e quando si ottiene la remissione.

Disegno e metodi della ricerca:

1. Caratterizzazione dell'apoptosi nei neutrofili di pazienti affetti da GPA Determinaremo il tasso di apoptosi dei neutrofili nel sangue intero.

   Metodologia:

   La ricerca sarà condotta sia sui neutrofili isolati da donatori sani di controllo ottenuti presso l'Istituto francese del sangue (Etablissement Français du Sang) sia da pazienti con vasculite del Dipartimento di medicina interna dell'ospedale di Cochin diretto dal professor Loïc Guillevin.

   L'apoptosi sarà indotta "fisiologicamente" nel sangue intero mediante incubazione notturna a 37°C.

   L'esternalizzazione della fosfatidilserina sarà misurata mediante citometria a flusso dopo la marcatura dell'annessina-V associata alla colorazione con 7-AAD per le cellule CD15+.

   Verrà inoltre utilizzata l'analisi Western blot utilizzando un anticorpo specifico contro il PCNA per visualizzarne l'espressione.

2. Analisi dell'espressione di scramblase, PR3, calreticulina, annessina A1, in neutrofili apoptotici da pazienti con GPA Determinaremo l'espressione di membrana di PR3, CRT, PLSCR, AxA1, in neutrofili apoptotici nei diversi sottogruppi di neutrofili: quelli non apoptotici (AnnexinV-, 7AAD -), neutrofili apoptotici precoci (AnnexinV+, 7AAD-) e neutrofili apoptotici tardivi (AnnexinV+, 7AAD+). Questa determinazione sarà effettuata per i pazienti al momento della diagnosi (in stato attivo; BVAS>3) e alla remissione.

   Metodologia

   • I neutrofili saranno isolati dal sangue mediante gradiente di destrano e Ficoll.
   • L'analisi di PR3, CRT, PLSCR, AxA1, espressione di membrana sarà misurata su neutrofili isolati mediante citometria a flusso dopo incubazione notturna a 37°C con valutazione dell'apoptosi mediante marcatura con annessina-V e colorazione con 7AAD.

3. Studio del burst respiratorio nei neutrofili dei pazienti con GPA Una delle principali funzioni dei neutrofili è la produzione di specie reattive dell'ossigeno, determineremo il metabolismo ossidativo dei neutrofili dovuto a diversi stimoli (f-MLP, sfere di zymosan opsonizzate per complemento, zymosan opsonizzate microsfere di IgG, PMA) con o senza un precedente priming di TNFa.

   Metodologia:

   L'esplorazione del burst respiratorio sarà effettuata su sangue intero con una tecnica chemiluminescente (luminol). I neutrofili saranno innescati dal TNFa o stimolati senza priming. La risposta burst sarà analizzata durante i 90 minuti successivi alla stimolazione.

4. Deregolazione del citochinoma neutrofilo I neutrofili sono in grado di sintetizzare un gran numero di citochine (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), fattori di crescita come GM-CSF e chimiochine come IL-8. Più recentemente è stato dimostrato che i neutrofili sono anche grandi produttori di BAFF (fattore di attivazione delle cellule B) e che la produzione è superiore a quella dei monociti o delle cellule dendritiche quando stimolati dall'INF-γ. Nella GPA i livelli sierici di BAFF hanno dimostrato di essere più alti rispetto ai controlli e recentemente le terapie mirate ai linfociti B hanno confermato in ampi studi controllati la loro importanza nell'AAV.

   Metodologia:

   Il siero dei pazienti sarà raccolto contemporaneamente ai neutrofili. Saranno analizzati utilizzando BD™ Cytometric Bead Array (CBA) con rilevamento di IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF e IL-12p70. I neutrofili che saranno isolati come in 1) saranno stimolati da INF-γ, LPS e G-CSF per analizzare la loro produzione e secrezione di BAFF/BlyS determinata mediante ELISA.

5. Deregolazione del proteoma dei neutrofili e studio funzionale di nuovi partner PR3 Gli studi sull'array genico hanno mostrato una probabile deregolazione dei neutrofili nell'AAV, in questo studio studieremo questa deregolazione a livello proteico.

Metodologia:

Per studiare il proteoma del paziente GPA quando attivo e in remissione rispetto ai controlli sani utilizzeremo un differenziale in elettroforesi su gel di campioni citosolici di neutrofili ottenuti per sonicazione. L'identificazione delle proteine ​​di interesse sarà effettuata mediante spettrometria di massa MALDI-TOF-TOF. Verrà eseguita la validazione funzionale di queste proteine ​​mediante sovraespressione o estinzione di siRNA.