Нейтрофилы как прогностические факторы при гранулематозе с полиангиитом (ранее называвшемся гранулематозом Вегенера) (NeutroVasc)

A - Конкретные цели Общая цель: Этот проект предназначен для изучения физиопатологических механизмов, связанных с ГПА на клеточном и молекулярном уровне. исследователи хотят изучить нейтрофилы как прогностические факторы и определить роль PR3, основного аутоантигена, в фазе разрешения воспаления.

Рабочая гипотеза исследователей состоит в том, что структурный и функциональный анализ PR3 в нейтрофилах поможет исследователям раскрыть его роль в GPA. Следовательно, наша долгосрочная цель состоит в том, чтобы лучше понять механизмы, участвующие в модуляции экспрессии PR3 на мембране нейтрофилов, чтобы ингибировать их активацию и предложить новые противовоспалительные терапевтические стратегии, адаптированные к GPA.

Настоящий проект: исследователи недавно продемонстрировали, что в нейтрофилах человека i) PR3 может экспрессироваться на мембране нейтрофилов во время апоптоза в отсутствие дегрануляции, ii) PR3 является членом молекулярного каркаса, включающего фосфолипидскрамблазу 1 (скрамблазу) и кальретикулин, экстернализируемых во время апоптоза. , iii) индуцированная апоптозом экспрессия мембраны PR3 нарушает репрограммирование макрофагов после фагоцитоза апоптотических нейтрофилов. Гипотеза исследователей состоит в том, что PR3 может иметь специфических молекулярных партнеров, которые могут способствовать его экстернализации и/или сохранению на плазматической мембране во время апоптоза нейтрофилов, тем самым усиливая его аутоиммунный ответ. -антигенная способность.

Конкретные цели:

1. Характеристика апоптоза в нейтрофилах больных ГПА
2. Анализ экспрессии партнеров PR3 (CD16, CD11b, кальретикулин, фосфолипидскрамблаза1) или коэкспрессируемого интересующего белка при воспалении (аннексин А1) в нейтрофилах пациентов с ГПА по сравнению со здоровым контролем
3. Идентификация новых партнеров PR3 в нейтрофилах
4. Анализ протеома нейтрофилов больных ГПА

B. Предыстория и значение 1.1. Введение ГПА представляет собой системный васкулит, который в основном связан с анти-PR3 ANCA. Роль активированных нейтрофилов в поражениях васкулита подтверждается их присутствием в периваскулярных инфильтратах, особенно в почечных клубочках и в легких.

PR3 представляет собой сериновую протеазу, впервые описанную в составе азурофильных гранул нейтрофилов, которые НЕ должны сливаться с плазматической мембраной, но высвобождаются внутри фаголизосом после фагоцитоза патогена. Мы впервые показали, что субклеточная локализация PR3 не ограничивается азурофильными гранулами, как считалось ранее, а что PR3 локализуется в секреторных везикулах, высокоподвижном компартменте, что объясняет присутствие PR3 на поверхности покоящихся изолированных клеток. нейтрофилы. Кроме того, высокий процент нейтрофилов, экспрессирующих PR3, наблюдаемый у больных васкулитом, можно рассматривать как фактор риска развития васкулита. Эта высокая экспрессия мембранного PR3 у пациентов с ГПА приводила к увеличению ANCA-индуцированного респираторного взрыва в нейтрофилах, что усиливало воспалительный процесс. In vitro связывание ANCA с PR3 вызывает респираторный взрыв, дегрануляцию и высвобождение провоспалительных цитокинов.

Поскольку экспрессия мембраны PR3 является важным патофизиологическим событием при ГПА, поскольку она является предпосылкой для последующей активации нейтрофилов с помощью ANCA, мы стремились определить механизмы, участвующие в экспрессии мембраны PR3. В нейтрофилах мы продемонстрировали, что апоптоз вызывает значительно повышенную экспрессию мембранного PR3 без дегрануляции. В этих опытах нам не удалось обнаружить МПО на мембране нейтрофилов. Наши результаты отличаются от ранее опубликованных данных, показывающих, что и MPO, и PR3 экстернализуются во время апоптоза из-за перемещения азурофильных гранул на плазматическую мембрану. Это явление, по-видимому, происходит, когда нейтрофилы подвергаются позднему апоптозу и вторичному некрозу, что приводит к экспрессии всех белков гранул на поверхности клетки.

Вызванная апоптозом экстернализация PR3 может иметь большое значение в патофизиологии ГПА, потому что PR3, который, как предполагалось, является внутриклеточным антигеном, таким образом экспонируется на плазматической мембране апоптотических клеток, тем самым усиливая свой провоспалительный потенциал, его иммуногенные свойства и препятствуя с фагоцитозом макрофагов. Мы также продемонстрировали, что во время апоптоза экспрессия PR3 связана с экспрессией кальретикулина, хорошо известного «сигнала съешь меня». Наконец, мы доказали, что присутствие PR3 ухудшает перепрограммирование макрофагов на противовоспалительный профиль после фагоцитоза апоптотических клеток по пути CRT/LRP.

Можно предположить, что экспрессия комплекса PR3/скрамблаза/CRT и других партнеров (CD11b, CD16) на поверхности апоптотических нейтрофилов может представлять собой хорошие маркеры прогноза. Исследования массива генов указали на нарушение регуляции нейтрофилов в GPA. Мы выдвигаем гипотезу о том, что протеом нейтрофилов пациентов с ГПА будет очень информативным в отношении состояния его активации, состояния выживания и что он может быть биологическим маркером клинической тяжести.

Таким образом, уместно изучить нарушение регуляции нейтрофилов на протяжении всего их жизненного цикла: их окислительный взрыв при активации, их физиологический апоптоз, экспрессию партнеров PR3. Это исследование будет проводиться на нейтрофилах пациентов с ГПА по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы с поправкой на возраст и пол.

C. Предварительные исследования. Анализ апоптоза в нейтрофилах пациентов с ГПА. В литературе было обнаружено, что нейтрофилы пациентов с ANCA-ассоциированным васкулитом (AAV) имеют нарушенный TNFα-индуцированный апоптоз и имеют тенденцию к более высокой скорости апоптоза, чем контрольная группа. Однако опубликованные данные о физиологическом апоптозе, который представляет собой спонтанный апоптоз, которому подвергаются нейтрофилы в отсутствие экзогенных стимулов, противоречивы. Когда в среду добавляют фетальную сыворотку теленка, нейтрофилы пациентов с ГПА демонстрируют такую ​​же скорость апоптоза, как и контрольная группа. Когда используется сыворотка пациентов, нейтрофилы от пациентов с ААВ в стадии ремиссии имеют более высокую выживаемость in vivo, чем контрольные, и эта разница исчезает при использовании нормальной сыворотки. Эти результаты согласуются с открытием, что пациенты с ГПА имеют высокую экспрессию PCNA, связанную с выживанием. Поэтому мы хотим изучить скорость апоптоза нейтрофилов при ГПА при постановке диагноза, во время рецидива и после ремиссии на цельной крови. Эти результаты будут сравниваться с контрольной группой, соответствующей возрасту и полу. Апоптоз будет оцениваться по экстернализации фосфатидилсерина, измеренной с помощью проточной цитометрии после мечения аннексином-V и окрашивания 7-AAD на клетках CD15+. Экспрессия PCNA также будет исследована на различных клинических стадиях, и будет выполнен протеомный профиль апоптотических нейтрофилов.

Анализ экспрессии скрамблазы/калретикулина в нейтрофилах пациентов с ГПА. На клеточной модели (клеточная линия RBL) мы продемонстрировали, что угасание скрамблазы под действием кшРНК было связано со снижением экспрессии фосфатидилсерина во время апоптоза, а экспрессия, индуцированная апоптозом PR3, также была нарушена (неопубликованные данные). данные). Мы также смогли продемонстрировать, что in vitro скрамблаза и PR3 физически взаимодействуют. Во время апоптоза PR3 также связывается с кальретикулином на мембране нейтрофилов. Эти данные предполагают, что ассоциация PR3/Scramblase/Calreticulin образует молекулярный каркас, который является функциональной платформой, которая может мешать путям распознавания (таким как CRT/LRP) между макрофагами и апоптозными нейтрофилами. Экспрессия этих партнеров на нейтрофильной мембране во время апоптоза будет исследована у пациентов при постановке диагноза и при достижении ремиссии.

Дизайн и методы исследования:

1. Характеристика апоптоза нейтрофилов у пациентов с ГПА Мы определим скорость апоптоза нейтрофилов в цельной крови.

   Методология:

   Исследования будут проводиться как на нейтрофилах, выделенных от здоровых контрольных доноров, полученных во Французском институте крови (Etablissement Français du Sang), так и у больных васкулитом из отделения внутренних болезней больницы Кочин под руководством профессора Лоика Гильвена.

   Апоптоз будет индуцироваться "физиологически" в цельной крови инкубацией в течение ночи при 37°С.

   Экстернализация фосфатидилсерина будет измеряться с помощью проточной цитометрии после мечения аннексином-V, связанного с окрашиванием 7-AAD для клеток CD15+.

   Вестерн-блот-анализ с использованием специфического антитела против PCNA также будет использоваться для визуализации его экспрессии.

2. Анализ экспрессии скрамблазы, PR3, кальретикулина, аннексина А1 в апоптотических нейтрофилах пациентов с ГПА Мы определим мембранную экспрессию PR3, CRT, PLSCR, AxA1 в апоптотических нейтрофилах в различных субпопуляциях нейтрофилов: неапоптотических (аннексин V-, 7AAD -), нейтрофилы с ранним апоптозом (AnnexinV+, 7AAD-) и нейтрофилы с поздним апоптозом (AnnexinV+, 7AAD+). Это определение будет проводиться для пациентов во время постановки диагноза (в активном состоянии; BVAS>3) и в период ремиссии.

   Методология

   • Нейтрофилы будут выделены из крови с использованием градиента декстрана и фиколла.
   • Исследование экспрессии PR3, CRT, PLSCR, AxA1, мембраны будет измеряться на изолированных нейтрофилах с помощью проточной цитометрии после инкубации в течение ночи при 37°C с оценкой апоптоза путем мечения аннексином-V и окрашивания 7AAD.

3. Изучение респираторного взрыва у нейтрофилов больных ГПА Одной из основных функций нейтрофилов является продукция активных форм кислорода, будем определять окислительный метаболизм нейтрофилов под действием различных стимулов (ф-МЛП, опсонизированные зимозановые шарики комплементом, опсонизированные зимозановые шарики). шарики с помощью IgG, PMA) с предварительным праймированием TNFα или без него.

   Методология:

   Исследование респираторного взрыва будет проводиться в цельной крови с помощью хемолюминесцентного (люминолового) метода. Нейтрофилы будут праймированы TNFα или стимулированы без праймирования. Пакетный ответ будет проанализирован в течение 90 минут после стимуляции.

4. Дерегуляция цитокинома нейтрофилов Нейтрофилы способны синтезировать большое количество цитокинов (ИЛ-1, ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-12), факторов роста, таких как GM-CSF, и химиокинов, таких как ИЛ-8. Совсем недавно было показано, что нейтрофилы также являются крупными продуцентами BAFF (фактора активации В-клеток) и что их продукция превосходит моноциты или дендритные клетки при стимуляции INF-γ. Было показано, что в GPA уровни BAFF в сыворотке выше, чем в контроле, и недавно терапевтические средства, нацеленные на B-лимфоциты, подтвердили в крупных контролируемых испытаниях их важность при AAV.

   Методология:

   Сыворотку пациентов будут собирать одновременно с нейтрофилами. Они будут проанализированы с помощью BD™ Cytometric Bead Array (CBA) с обнаружением IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF и IL-12p70. Нейтрофилы, которые будут выделены, как в 1), будут стимулированы INF-γ, LPS и G-CSF для анализа их продукции и секреции BAFF/BlyS, определенных с помощью ELISA.

5. Нарушение регуляции протеома нейтрофилов и функциональное исследование новых партнеров PR3 Исследования массива генов показали вероятное нарушение регуляции нейтрофилов в AAV, в этом исследовании мы изучим это нарушение регуляции на уровне белка.

Методология:

Для изучения протеома пациента с ГПА в активном состоянии и в состоянии ремиссии по сравнению со здоровым контролем мы будем использовать дифференциальный гель-электрофорез цитозольных образцов нейтрофилов, полученных с помощью ультразвука. Идентификация представляющих интерес белков будет проводиться с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF. Будет проведена функциональная проверка этих белков сверхэкспрессией или вымиранием миРНК.