다발혈관염을 동반한 육아종증(구 베게너 육아종증)의 예후인자로서의 호중구 (NeutroVasc)

A - 특정 목표 일반 목표: 이 프로젝트는 세포 및 분자 수준에서 GPA와 관련된 생리병리학적 메커니즘을 연구하도록 설계되었습니다. 연구자들은 예후 인자로서 호중구를 연구하고 염증의 해결 단계에서 주요 자가항원인 PR3의 의미를 결정하기를 원합니다.

조사관의 작업 가설은 호중구에서 PR3의 구조적 및 기능적 분석이 조사관이 GPA에서 PR3의 역할을 밝히는 데 도움이 될 것이라는 것입니다. 따라서 우리의 장기적인 목표는 호중구의 막에서 PR3 발현의 조절과 관련된 메커니즘을 더 잘 이해하여 활성화를 억제하고 GPA에 적합한 새로운 항염증 치료 전략을 제안하는 것입니다.

현재 프로젝트: 연구자들은 최근 인간 호중구에서 i) PR3가 탈과립 없이 세포사멸 동안 호중구의 막에서 발현될 수 있음을 입증했습니다. , iii) 세포사멸 유발 PR3 막 발현은 세포사멸성 호중구의 식세포작용 후 대식세포 재프로그래밍을 손상시킨다 연구자의 가설은 PR3가 외부화를 촉진할 수 있는 특정 분자 파트너를 가질 수 있고/또는 호중구 세포사멸 동안 원형질막에서의 지속성을 촉진할 수 있다는 것입니다. -항원 능력.

구체적인 목표는 다음과 같습니다.

1. GPA 환자의 호중구에서 세포 사멸의 특성
2. 건강한 대조군과 비교하여 GPA 환자의 호중구에서 PR3 파트너(CD16, CD11b, Calreticulin, Phospholipidscramblase1) 또는 염증에 대한 공동 발현 관심 단백질(AnnexinA1,) 발현 분석
3. 호중구에서 PR3의 새로운 파트너 식별
4. GPA 환자의 호중구의 프로테옴 분석

나. 배경 및 의의 1.1. 소개 GPA는 주로 항-PR3 ANCA와 관련된 전신 혈관염입니다. 혈관염 병변에서 활성화된 호중구의 역할은 혈관주위 침윤물, 특히 신장 사구체 및 폐에서의 존재에 의해 제안됩니다.

PR3는 원형질막과 융합하지 않을 것으로 예상되지만 병원체의 식균작용 후 포식용해소체 내에서 방출되는 호중구의 아주로필릭 과립 내에서 처음 기술된 세린 프로테아제입니다. 우리는 PR3의 세포 내 위치가 이전에 생각했던 것처럼 아주로필릭 과립에 국한되지 않고 PR3가 고도로 이동 가능한 구획인 분비 소포에 위치한다는 것을 처음으로 보여주었고, 따라서 격리된 표면에 PR3의 존재를 설명했습니다. 호중구. 또한, 혈관염 환자에서 관찰되는 PR3를 발현하는 호중구의 높은 비율이 혈관염의 위험 인자로 간주될 수 있습니다. GPA 환자에서 이러한 막 PR3의 높은 발현은 호중구에서 ANCA에 의해 유발된 호흡 폭발의 증가를 초래하여 염증 과정을 강화합니다. 시험관 내에서 ANCA와 PR3의 결합은 호흡 폭발, 탈과립화 및 전 염증성 사이토카인의 방출을 유발합니다.

PR3 막 발현은 ANCA에 의한 호중구의 후속 활성화를 위한 전제조건이기 때문에 GPA에서 중요한 병태생리학적 사건이기 때문에, 우리는 PR3 막 발현과 관련된 메커니즘을 결정하고자 했습니다. 호중구에서, 우리는 탈과립화 없이 세포자멸사가 현저하게 증가된 막 PR3 발현을 유발함을 입증했습니다. 이 실험에서 우리는 호중구 막에서 MPO를 감지하지 못했습니다. 우리의 결과는 azurophilic 과립이 원형질막으로 전이되기 때문에 MPO와 PR3가 세포 사멸 중에 외부화되었음을 보여주는 이전에보고 된 데이터와 다릅니다. 이 현상은 호중구가 늦은 세포 사멸 및 이차 괴사를 겪을 때 발생하여 세포 표면의 모든 과립 단백질 발현으로 이어지는 것으로 보입니다.

Apoptosis 유발 PR3 외부화는 GPA의 병리 생리학에서 큰 관련이 있을 수 있습니다. 왜냐하면 세포 내 항원으로 추정되는 PR3가 세포 사멸 세포의 원형질막에 노출되어 염증 유발 가능성, 면역원성 특성 및 간섭을 증폭시키기 때문입니다. 대 식세포 식균 작용. 우리는 또한 세포 사멸 동안 PR3 발현이 잘 알려진 "eat-me 신호"인 calreticulin의 발현과 관련이 있음을 입증했습니다. 우리는 마침내 PR3의 존재가 CRT/LRP 경로를 통한 세포사멸 세포의 식세포작용 후 대식세포의 항염증 프로파일로의 재프로그래밍을 손상시킨다는 것을 입증했습니다.

apoptotic neutrophils의 표면에서 복잡한 PR3/scramblase/CRT 및 기타 파트너(CD11b, CD16)의 발현이 좋은 예후 마커를 구성할 수 있다는 가설을 세울 수 있습니다. Gene array 연구는 GPA에서 neutrophils의 탈조절을 지적했습니다. 우리는 GPA 환자의 호중구의 프로테옴이 활성화 상태, 생존 상태에 대해 매우 유익하고 임상적 중증도의 생물학적 마커가 될 수 있다는 가설을 세웁니다.

따라서 호중구의 모든 수명 주기 동안의 조절 완화를 연구하는 것이 적절합니다: 활성화 하에서의 산화 폭발, 생리학적 세포사멸, PR3 파트너의 발현. 이 연구는 연령 및 성별 조정된 건강한 대조군과 비교하여 GPA 환자의 호중구에서 수행될 것입니다.

C. 예비 연구 GPA 환자 호중구의 세포사멸 분석 문헌에서 ANCA 관련 혈관염(AAV) 환자의 호중구는 TNFα에 의해 유발된 세포사멸 장애가 있는 것으로 밝혀졌으며 대조군보다 세포사멸 비율이 더 높은 경향이 있습니다. 그러나, 외인성 자극이 없을 때 호중구가 겪는 자발적 세포사멸인 생리적 세포사멸에 대한 발표된 데이터는 모순됩니다. 송아지 태아 혈청을 배지에 첨가하면 GPA 환자의 호중구는 대조군과 유사한 세포 사멸률을 나타냅니다. 환자의 혈청을 사용할 경우 관해 상태에 있는 AAV 환자의 호중구는 대조군보다 생체 내 생존율이 더 높으며 이러한 차이는 정상 혈청을 사용할 때 사라집니다. 이러한 결과는 GPA 환자가 생존과 관련된 PCNA의 발현이 높다는 발견과 일치합니다. 따라서 진단 시, 재발 시 및 완화 후 전혈에서 GPA의 호중구 세포사멸률을 연구하고자 합니다. 이 결과는 연령 및 성별 일치 대조군과 비교됩니다. 아폽토시스는 CD15+ 세포에 대한 아넥신-V 라벨링 및 7-AAD 염색 후 유동 세포측정법에 의해 측정된 포스파티딜세린 외부화에 의해 평가될 것이다. PCNA 발현은 또한 상이한 임상 단계에서 조사될 것이며 세포사멸성 호중구의 단백질 프로파일이 수행될 것이다.

GPA 환자의 호중구에서 scramblase/Calreticulin 발현 분석 세포 모델(RBL 세포주)에서 우리는 shRNA에 의한 scramblase 소멸이 세포사멸 동안 포스파티딜세린의 발현 감소와 관련이 있고 PR3 세포사멸 유도 발현도 손상됨을 입증했습니다(미공개 데이터). 우리는 또한 in vitro scramblase와 PR3가 물리적으로 상호 작용한다는 것을 입증할 수 있었습니다. 아폽토시스 동안 PR3는 또한 호중구 막에서 칼레티쿨린과 연관됩니다. 이러한 데이터는 연합 PR3/Scramblase/Calreticulin이 대식세포와 세포사멸 호중구 사이의 인식 경로(예: CRT/LRP)를 방해할 수 있는 기능적 플랫폼인 분자 스캐폴드를 형성함을 시사합니다. 아폽토시스 동안 호중구 막에서의 이들 파트너의 발현은 진단 시 및 완화가 얻어질 때 환자에서 조사될 것이다.

연구 설계 및 방법:

1. GPA 환자의 호중구에서 아폽토시스의 특성화 우리는 전혈에서 호중구의 아폽토시스 비율을 결정할 것입니다.

   방법론:

   연구는 프랑스 혈액 연구소(Etablissement Français du Sang)에서 얻은 건강한 대조군 공여자와 Loic Guillevin 교수가 이끄는 Cochin 병원 내과의 혈관염 환자로부터 분리된 호중구 모두에 대해 수행될 것입니다.

   아폽토시스는 37°C에서 밤새 배양함으로써 전혈에서 "생리학적"으로 유도될 것입니다.

   포스파티딜세린 외부화는 CD15+ 세포에 대한 7-AAD 염색과 관련된 아넥신-V 라벨링 후 유동 세포측정법에 의해 측정될 것이다.

   PCNA에 대한 특정 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석도 그 발현을 시각화하는 데 사용됩니다.

2. GPA 환자의 세포사멸 호중구에서 scramblase, PR3, calreticulin, AnnexinA1 발현 분석 -), 초기 세포사멸 호중구(AnnexinV+, 7AAD-) 및 후기 세포사멸 호중구(AnnexinV+, 7AAD+). 이 결정은 진단 시점(활성 상태, BVAS>3) 및 관해 시 환자에 대해 수행됩니다.

   방법론

   • 호중구는 Dextran 기울기와 Ficoll을 사용하여 혈액에서 분리됩니다.
   • PR3, CRT, PLSCR, AxA1, 막 발현의 조사는 아넥신-V 라벨링 및 7AAD 염색에 의한 아폽토시스의 평가와 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 유동 세포측정법에 의해 분리된 호중구에서 측정될 것이다.

3. GPA 환자의 호중구에서 호흡 폭발에 대한 연구 호중구의 주요 기능 중 하나는 활성 산소 종의 생성이며, 다양한 자극(f-MLP, 보체에 의한 옵소닌화된 자이모산 비드, 옵소닌화된 자이모산 이전에 TNFα에 의한 프라이밍이 있거나 없는 비드(IgG, PMA에 의한 비드).

   방법론:

   화학발광(루미놀) 기술을 사용하여 전혈에서 호흡 폭발의 탐색을 수행합니다. 호중구는 TNFα에 의해 프라이밍되거나 프라이밍 없이 자극됩니다. 버스트 응답은 자극 후 90분 동안 분석됩니다.

4. 호중구 사이토키놈의 탈조절 호중구는 수많은 사이토카인(IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), GM-CSF와 같은 성장 인자 및 IL-8과 같은 키미오카인을 합성할 수 있습니다. 보다 최근에는 호중구가 BAFF(B 세포 활성화 인자)의 훌륭한 생산자이며 INF-γ에 의해 자극될 때 단핵구 또는 수지상 세포에 의한 생산보다 우수하다는 것이 밝혀졌습니다. GPA 혈청에서 BAFF 수준은 대조군보다 높은 것으로 나타났으며 최근에 B-림프구 치료제를 표적으로 하는 대규모 통제 시험에서 AAV에서의 중요성이 확인되었습니다.

   방법론:

   환자의 혈청은 호중구와 동시에 수집됩니다. IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF 및 IL-12p70을 검출하는 BD™ CBA(Cytometric Bead Array)를 사용하여 분석합니다. 1)에서와 같이 분리될 호중구는 INF-γ, LPS 및 G-CSF에 의해 자극되어 ELISA에 의해 결정된 BAFF/BlyS의 생산 및 분비를 분석할 것입니다.

5. 호중구 프로테옴의 규제 완화 및 새로운 PR3 파트너의 기능적 연구 유전자 배열 연구는 AAV에서 호중구의 가능한 규제 완화를 보여주었고, 이 연구에서 우리는 단백질 수준에서 이 규제 완화를 연구할 것입니다.

방법론:

GPA 환자의 프로테옴을 연구하기 위해 건강한 대조군과 비교하여 활성 및 차도 상태일 때 초음파 처리로 얻은 호중구의 세포질 샘플의 겔 전기영동에서 차이를 사용합니다. 관심 있는 단백질의 식별은 질량 분석기 MALDI-TOF-TOF로 수행됩니다. 과발현 또는 siRNA 소멸에 의한 이들 단백질의 기능 검증이 수행될 것이다.