Neutrófilos como fatores prognósticos na granulomatose com poliangiite (anteriormente denominada granulomatose de Wegener) (NeutroVasc)

A - Objetivos Específicos Objetivo geral: Este projeto visa estudar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos na GPA a nível celular e molecular. os investigadores querem estudar os neutrófilos como fatores prognósticos e determinar a implicação do PR3, o principal autoantígeno na fase de resolução da inflamação.

a hipótese de trabalho dos investigadores é que a análise estrutural e funcional de PR3 em neutrófilos ajudará os investigadores a desvendar seu papel no GPA. Assim, nosso objetivo de longo prazo é entender melhor os mecanismos envolvidos na modulação da expressão de PR3 na membrana de neutrófilos, a fim de inibir sua ativação e propor novas estratégias terapêuticas anti-inflamatórias adaptadas ao GPA.

Projeto atual: Os pesquisadores demonstraram recentemente que em neutrófilos humanos i) PR3 pode ser expresso na membrana de neutrófilos durante a apoptose na ausência de degranulação, ii) PR3 é um membro de um andaime molecular compreendendo fosfolipídioscramblase1 (scramblase) e calreticulina externalizada durante a apoptose , iii) expressão de membrana de PR3 induzida por apoptose prejudica a reprogramação de macrófagos após fagocitose de neutrófilos apoptóticos -capacidade antigênica.

Os objetivos específicos são:

1. Caracterização da apoptose em neutrófilos de pacientes com GPA
2. Análise de parceiros PR3 (CD16, CD11b, Calreticulina, Fosfolipídioscramblase1) ou proteína co-expressa de interesse na expressão da inflamação (Anexina A1,) em neutrófilos de pacientes com GPA em comparação com controles saudáveis
3. Identificação de novos parceiros de PR3 em neutrófilos
4. Análise do proteoma de neutrófilos de pacientes GPA

B. Antecedentes e Importância 1.1. Introdução A GPA é uma vasculite sistêmica associada principalmente ao ANCA anti-PR3. O papel dos neutrófilos ativados nas lesões de vasculite é sugerido por sua presença em infiltrados perivasculares, especialmente nos glomérulos renais e no pulmão.

PR3 é uma serina protease descrita pela primeira vez dentro de grânulos azurófilos de neutrófilos que NÃO devem se fundir com a membrana plasmática, mas são liberados dentro do fagolisossomo após a fagocitose do patógeno. Mostramos pela primeira vez que a localização subcelular de PR3 não estava restrita a grânulos azurófilos, como se pensava anteriormente, mas que PR3 estava localizada em vesículas secretoras, um compartimento altamente mobilizável, explicando assim a presença de PR3 na superfície de repouso isolado neutrófilos. Além disso, uma alta porcentagem de neutrófilos expressando PR3 observada em pacientes com vasculite pode ser considerada um fator de risco para vasculite. Essa alta expressão de PR3 de membrana em pacientes com GPA resultou em um aumento na explosão respiratória induzida por ANCA em neutrófilos, aumentando assim o processo inflamatório. In vitro, a ligação do ANCA ao PR3 desencadeia a explosão respiratória, a desgranulação e a liberação de citocinas pró-inflamatórias.

Como a expressão da membrana PR3 é um evento fisiopatológico importante na GPA, uma vez que é um pré-requisito para a ativação subsequente de neutrófilos pelo ANCA, buscamos determinar os mecanismos envolvidos na expressão da membrana PR3. Em neutrófilos, demonstramos que a apoptose desencadeou um aumento significativo da expressão de PR3 na membrana sem degranulação. Nesses experimentos, falhamos em detectar MPO na membrana dos neutrófilos. Nossos resultados diferem dos dados relatados anteriormente, mostrando que tanto MPO quanto PR3 foram exteriorizados durante a apoptose devido à translocação de grânulos azurófilos para a membrana plasmática. Esse fenômeno parece ocorrer quando os neutrófilos sofrem apoptose tardia e necrose secundária, levando à expressão de todas as proteínas granulares na superfície celular.

A externalização do PR3 induzida pela apoptose pode ser de grande relevância na fisiopatologia da GPA, pois o PR3, que se supunha ser um antígeno intracelular, é exposto na membrana plasmática de células apoptóticas, ampliando seu potencial pró-inflamatório, suas propriedades imunogênicas e interferindo com fagocitose de macrófagos. Também demonstramos que durante a apoptose a expressão de PR3 está associada à expressão de calreticulina, um conhecido "sinal de comer-me". Finalmente, evidenciamos que a presença de PR3 prejudica a reprogramação de macrófagos para um perfil anti-inflamatório após a fagocitose de células apoptóticas pela via CRT/LRP.

Pode-se supor que a expressão do complexo PR3/scramblase/CRT e outros parceiros (CD11b, CD16) na superfície de neutrófilos apoptóticos possam constituir marcadores de bom prognóstico. Estudos de arranjo genético têm apontado uma desregulação de neutrófilos em GPA. Levantamos a hipótese de que o proteoma de neutrófilos de pacientes com GPA seria muito informativo de seu estado de ativação, estado de sobrevivência e que poderia ser um marcador biológico de gravidade clínica.

É assim pertinente estudar a desregulação dos neutrófilos durante todo o seu ciclo de vida: o seu surto oxidativo sob ativação, a sua apoptose fisiológica, a expressão dos parceiros PR3. Este estudo será realizado em neutrófilos de pacientes com GPA em comparação com controles saudáveis ​​ajustados por idade e sexo.

C. Estudos preliminares Análise de apoptose em neutrófilos de pacientes com GPA Na literatura, neutrófilos de pacientes com vasculite associada a ANCA (AAV) apresentaram apoptose induzida por TNFα perturbada e tendem a ter uma taxa de apoptose mais alta do que os controles. No entanto, os dados publicados sobre apoptose fisiológica, que é a apoptose espontânea que os neutrófilos sofrem na ausência de estímulos exógenos, são contraditórios. Quando o soro fetal de vitelo é adicionado ao meio, os neutrófilos dos pacientes com GPA exibem uma taxa de apoptose semelhante à dos controles. Quando o soro de pacientes é usado, os neutrófilos de pacientes com VAA em remissão têm uma taxa de sobrevida in vivo maior do que os controles, e essa diferença desaparece quando o soro normal é usado. Esses resultados estão de acordo com a descoberta de que os pacientes com GPA têm uma alta expressão de PCNA que está associada à sobrevida. Portanto, queremos estudar a taxa de apoptose de neutrófilos em GPA no diagnóstico, durante a recidiva e após a remissão em sangue total. Esses resultados serão comparados com controles pareados por idade e sexo. A apoptose será avaliada pela externalização de fosfatidilserina medida por citometria de fluxo após marcação com anexina-V e coloração com 7-AAD em células CD15+. A expressão de PCNA também será investigada nas diferentes fases clínicas e o perfil proteômico de neutrófilos apoptóticos será realizado.

Análise da expressão de scramblase/calreticulina em neutrófilos de pacientes com GPA Em um modelo celular (linha celular RBL), demonstramos que a extinção de scramblase por shRNA estava associada a uma expressão diminuída de fosfatidilserina durante a apoptose e que a expressão induzida por apoptose de PR3 também foi prejudicada (não publicado dados). Também fomos capazes de demonstrar que in vitro scramblase e PR3 interagem fisicamente. Durante a apoptose, o PR3 também está associado à calreticulina na membrana dos neutrófilos. Esses dados sugerem que a associação PR3/Scramblase/Calreticulina forma um andaime molecular que é uma plataforma funcional que pode interferir em vias de reconhecimento (como CRT/LRP) entre macrófagos e neutrófilos apoptóticos. A expressão desses parceiros na membrana dos neutrófilos durante a apoptose será investigada em pacientes no momento do diagnóstico e quando a remissão for obtida.

Projeto de pesquisa e métodos:

1. Caracterização da apoptose em neutrófilos de pacientes com GPA Determinaremos a taxa de apoptose de neutrófilos em sangue total.

   Metodologia:

   A pesquisa será realizada tanto em neutrófilos isolados de doadores de controle saudáveis ​​obtidos no French Blood Institute (Etablissement Français du Sang) quanto em pacientes com vasculite do Departamento de Medicina Interna do Cochin Hospital, chefiado pelo Professor Loïc Guillevin.

   A apoptose será induzida "fisiologicamente" em sangue total por incubação durante a noite a 37°C.

   A externalização da fosfatidilserina será medida por citometria de fluxo após marcação com anexina-V associada à coloração com 7-AAD para células CD15+.

   A análise de Western blot usando um anticorpo específico contra PCNA também será usada para visualizar sua expressão.

2. Análise da expressão de scramblase, PR3, calreticulina, Anexina A1 em neutrófilos apoptóticos de pacientes com GPA Determinaremos a expressão de membrana de PR3, CRT, PLSCR, AxA1, em neutrófilos apoptóticos nos diferentes subconjuntos de neutrófilos: não apoptóticos (Anexina V-, 7AAD -), neutrófilos apoptóticos precoces (Anexina V+, 7AAD-) e neutrófilos apoptóticos tardios (Anexina V+, 7AAD+). Essa determinação será feita para os pacientes no momento do diagnóstico (em estado ativo; BVAS>3) e na remissão.

   Metodologia

   • Neutrófilos serão isolados do sangue utilizando gradiente de Dextran e Ficoll.
   • A investigação da expressão de PR3, CRT, PLSCR, AxA1, membrana será medida em neutrófilos isolados por citometria de fluxo após incubação noturna a 37°C com avaliação de apoptose por marcação com anexina-V e coloração com 7AAD.

3. Estudo da explosão respiratória em neutrófilos de pacientes com GPA Uma das principais funções dos neutrófilos é a produção de espécies reativas de oxigênio, determinaremos o metabolismo oxidativo dos neutrófilos devido a diferentes estímulos (f-MLP, grânulos de zymosan opsonizados por complemento, zymosan opsonizados grânulos por IgG, PMA) com ou sem priming prévio por TNFα.

   Metodologia:

   A exploração da explosão respiratória será feita em sangue total com uma técnica quimioluminescente (luminol). Os neutrófilos serão iniciados por TNFα ou estimulados sem iniciação. A resposta do burst será analisada durante 90 minutos após a estimulação.

4. Desregulação dos neutrófilos Citocinoma Os neutrófilos são capazes de sintetizar um grande número de citocinas (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), fatores de crescimento como GM-CSF e quimiocinas como IL-8. Mais recentemente, foi demonstrado que os neutrófilos também são grandes produtores de BAFF (fator ativador de células B) e que a produção é superior à de monócitos ou células dendríticas quando estimulados por INF-γ. No soro de GPA, os níveis de BAFF mostraram ser mais altos do que os controles e, recentemente, a terapêutica direcionada aos linfócitos B confirmou em grandes ensaios controlados sua importância na AAV.

   Metodologia:

   O soro dos pacientes será coletado ao mesmo tempo que os neutrófilos. Eles serão analisados ​​usando BD™ Cytometric Bead Array (CBA) com detecção de IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF e IL-12p70. Neutrófilos que serão isolados como em 1) serão estimulados por INF-γ, LPS e G-CSF para análise de sua produção e secreção de BAFF/BlyS determinada por ELISA.

5. Desregulação do Proteoma neutrófilo e estudo funcional de novos parceiros PR3 Estudos de arranjo genético mostraram uma provável desregulação de neutrófilos em AAV, neste estudo estudaremos esta desregulação ao nível da proteína.

Metodologia:

Para estudar o proteoma do paciente GPA quando ativo e em remissão em comparação com controles saudáveis, usaremos um diferencial em eletroforese em gel de amostras citosólicas de neutrófilos obtidas por sonicação. A identificação das proteínas de interesse será feita por espectrometria de massa MALDI-TOF-TOF. A validação funcional dessas proteínas por superexpressão ou extinção de siRNA será realizada.