Neutrofile jako czynniki prognostyczne w ziarniniakowatości z zapaleniem wielonaczyniowym (wcześniej nazywanej ziarniniakowatością Wegenera) (NeutroVasc)

A - Cele szczegółowe Cel ogólny: Projekt ma na celu zbadanie mechanizmów fizjopatologicznych zaangażowanych w GPA na poziomie komórkowym i molekularnym. badacze chcą zbadać neutrofile jako czynniki prognostyczne i określić wpływ PR3, głównego autoantygenu na fazę ustępowania stanu zapalnego.

hipoteza robocza badaczy jest taka, że ​​strukturalna i funkcjonalna analiza PR3 w neutrofilach pomoże badaczom odkryć jego rolę w GPA. Dlatego naszym długoterminowym celem jest lepsze zrozumienie mechanizmów zaangażowanych w modulację ekspresji PR3 na błonie neutrofili w celu zahamowania ich aktywacji i zaproponowanie nowych przeciwzapalnych strategii terapeutycznych dostosowanych do GPA.

Obecny projekt: Badacze niedawno wykazali, że w ludzkich neutrofilach i) PR3 może ulegać ekspresji na błonie neutrofilów podczas apoptozy przy braku degranulacji, ii) PR3 jest członkiem rusztowania molekularnego obejmującego fosfolipidskramblazę1 (scramblase) i kalretikulinę uzewnętrznioną podczas apoptozy , iii) indukowana apoptozą ekspresja błonowa PR3 upośledza przeprogramowanie makrofagów po fagocytozie apoptotycznych neutrofili Hipoteza badaczy jest taka, że ​​PR3 może mieć specyficznych partnerów molekularnych, którzy mogą ułatwiać jego eksternalizację i/lub utrzymywanie się w błonie plazmatycznej podczas apoptozy neutrofili, wzmacniając w ten sposób jego auto -zdolność antygenowa.

Cele szczegółowe to:

1. Charakterystyka apoptozy w neutrofilach od pacjentów z GPA
2. Analiza partnerów PR3 (CD16, CD11b, Kalretikulina, Phospholipidscramblase1) lub koeksprymowane białko będące przedmiotem zainteresowania w zapaleniu (aneksyna A1,) ekspresja w neutrofilach od pacjentów z GPA w porównaniu ze zdrowymi kontrolami
3. Identyfikacja nowych partnerów PR3 w neutrofilach
4. Analiza proteomu neutrofili od pacjentów z GPA

B. Kontekst i znaczenie 1.1. Wprowadzenie GPA jest układowym zapaleniem naczyń, które jest związane głównie z anty-PR3 ANCA. O roli aktywowanych neutrofilów w zmianach typu vasculitis świadczy ich obecność w naciekach okołonaczyniowych, zwłaszcza w kłębuszkach nerkowych iw płucach.

PR3 jest proteazą serynową opisaną po raz pierwszy w azurofilowych ziarnistościach neutrofili, które NIE powinny łączyć się z błoną plazmatyczną, ale są uwalniane w fagolizosomie po fagocytozie patogenu. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że subkomórkowa lokalizacja PR3 nie była ograniczona do granulek azurofilowych, jak wcześniej sądzono, ale że PR3 był zlokalizowany w pęcherzykach wydzielniczych, kompartmencie wysoce mobilnym, wyjaśniając w ten sposób obecność PR3 na powierzchni spoczynkowej izolowanej neutrofile. Ponadto wysoki odsetek neutrofili z ekspresją PR3 obserwowany u pacjentów z zapaleniem naczyń można uznać za czynnik ryzyka zapalenia naczyń. Ta wysoka ekspresja błonowego PR3 u pacjentów z GPA spowodowała wzrost wywołanego przez ANCA wybuchu oddechowego w neutrofilach, wzmacniając w ten sposób proces zapalny. In vitro wiązanie się ANCA z PR3 wyzwala wybuch oddechowy, degranulację i uwalnianie cytokin prozapalnych.

Ponieważ ekspresja błony PR3 jest ważnym zdarzeniem patofizjologicznym w GPA, ponieważ jest warunkiem wstępnym późniejszej aktywacji neutrofili przez ANCA, staraliśmy się określić mechanizmy zaangażowane w ekspresję błony PR3. W neutrofilach wykazaliśmy, że apoptoza wyzwala znacząco zwiększoną ekspresję błony PR3 bez degranulacji. W tych eksperymentach nie udało nam się wykryć MPO na błonie neutrofili. Nasze wyniki różnią się od wcześniej zgłoszonych danych pokazujących, że zarówno MPO, jak i PR3 zostały uzewnętrznione podczas apoptozy z powodu translokacji granulek azurofilowych do błony plazmatycznej. Wydaje się, że zjawisko to występuje, gdy neutrofile przechodzą późną apoptozę i wtórną martwicę, co prowadzi do ekspresji wszystkich białek ziarnistych na powierzchni komórki.

Indukowana apoptozą eksternalizacja PR3 może mieć duże znaczenie w patofizjologii GPA, ponieważ PR3, który miał być antygenem wewnątrzkomórkowym, jest w ten sposób eksponowany na błonie plazmatycznej komórek apoptotycznych, wzmacniając w ten sposób swój potencjał prozapalny, właściwości immunogenne i zakłócając z fagocytozą makrofagów. Wykazaliśmy również, że podczas apoptozy ekspresja PR3 jest związana z ekspresją kalretikuliny, dobrze znanego „sygnału zjedz mnie”. W końcu udowodniliśmy, że obecność PR3 upośledza przeprogramowanie makrofagów na profil przeciwzapalny po fagocytozie komórek apoptotycznych poprzez szlak CRT/LRP.

Można postawić hipotezę, że ekspresja kompleksu PR3/scramblasa/CRT i innych partnerów (CD11b, CD16) na powierzchni apoptotycznych neutrofili może stanowić dobre markery rokownicze. Badania macierzy genów wykazały deregulację neutrofili w GPA. Stawiamy hipotezę, że proteom neutrofili pacjentów z GPA byłby bardzo pouczający o jego stanie aktywacji, stanie przeżycia i że mógłby być biologicznym markerem ciężkości klinicznej.

Dlatego istotne jest zbadanie deregulacji neutrofili podczas całego ich cyklu życiowego: ich wybuchu oksydacyjnego podczas aktywacji, ich fizjologicznej apoptozy, ekspresji partnerów PR3. To badanie zostanie przeprowadzone na neutrofilach od pacjentów z GPA w porównaniu ze zdrowymi kontrolami dostosowanymi do wieku i płci.

C. Badania wstępne Analiza apoptozy w neutrofilach od pacjentów z GPA W literaturze stwierdzono, że neutrofile od pacjentów z zapaleniem naczyń związanym z ANCA (AAV) mają zaburzoną apoptozę indukowaną przez TNFα i wykazują tendencję do wyższego tempa apoptozy niż grupy kontrolne. Jednak opublikowane dane dotyczące apoptozy fizjologicznej, która jest spontaniczną apoptozą, której ulegają neutrofile przy braku bodźców egzogennych, są sprzeczne. Gdy do pożywki dodaje się cielęcą surowicę płodową, neutrofile od pacjentów z GPA wykazują podobną szybkość apoptozy jak kontrole. Kiedy stosuje się surowicę pacjentów, neutrofile od pacjentów z AAV w remisji mają wyższy wskaźnik przeżywalności in vivo niż grupy kontrolne, a różnica ta znika, gdy stosuje się normalną surowicę. Wyniki te są zgodne z odkryciem, że pacjenci z GPA mają wysoką ekspresję PCNA, co jest związane z przeżyciem. Dlatego chcemy zbadać szybkość apoptozy neutrofili w GPA w momencie rozpoznania, podczas nawrotu i po remisji w pełnej krwi. Wyniki te zostaną porównane z kontrolami dobranymi pod względem wieku i płci. Apoptoza będzie oceniana przez eksternalizację fosfatydyloseryny mierzoną metodą cytometrii przepływowej po znakowaniu aneksyną-V i barwieniu 7-AAD na komórkach CD15+. Zbadana zostanie również ekspresja PCNA na różnym etapie klinicznym oraz wykonany zostanie profil proteomiczny apoptotycznych neutrofili.

Analiza ekspresji skramblazy/ kalretikuliny w neutrofilach pacjentów z GPA W modelu komórkowym (linia komórkowa RBL) wykazaliśmy, że wygaszanie skramblazy przez shRNA było związane ze zmniejszoną ekspresją fosfatydyloseryny podczas apoptozy oraz że ekspresja indukowana apoptozą PR3 była również upośledzona (niepublikowane dane). Byliśmy również w stanie wykazać, że scramblaza in vitro i PR3 oddziałują fizycznie. Podczas apoptozy PR3 jest również związany z kalretikuliną na błonie neutrofili. Dane te sugerują, że asocjacja PR3/Scramblase/Kalretikulina tworzy rusztowanie molekularne, które jest funkcjonalną platformą, która może zakłócać szlaki rozpoznawania (takie jak CRT/LRP) między makrofagami a apoptotycznymi neutrofilami. Ekspresja tych partnerów na błonie neutrofili podczas apoptozy będzie badana u pacjentów w momencie rozpoznania i po uzyskaniu remisji.

Projekt badawczy i metody:

1. Charakterystyka apoptozy neutrofili od pacjentów z GPA Określimy szybkość apoptozy neutrofili we krwi pełnej.

   Metodologia:

   Badania będą prowadzone zarówno na neutrofilach wyizolowanych od zdrowych dawców kontrolnych uzyskanych we Francuskim Instytucie Krwiodawstwa (Etablissement Français du Sang), jak i od pacjentów z zapaleniem naczyń z Oddziału Chorób Wewnętrznych Szpitala w Cochin kierowanego przez profesora Loïca Guillevina.

   Apoptoza będzie indukowana „fizjologicznie” w pełnej krwi przez całonocną inkubację w temperaturze 37°C.

   Eksternalizacja fosfatydyloseryny będzie mierzona za pomocą cytometrii przepływowej po znakowaniu aneksyną-V związanym z barwieniem 7-AAD dla komórek CD15+.

   Analiza Western blot przy użyciu swoistego przeciwciała przeciwko PCNA zostanie również wykorzystana do wizualizacji jego ekspresji.

2. Analiza ekspresji skramblazy, PR3, kalretikuliny, aneksyny A1 w apoptotycznych neutrofilach pacjentów z GPA Określimy błonową ekspresję PR3, CRT, PLSCR, AxA1 w apoptotycznych neutrofilach w różnych podzbiorach neutrofili: nieapoptotycznych (AnnexinV-, 7AAD -), wczesne apoptotyczne neutrofile (AnexinV+, 7AAD-) i późne apoptotyczne neutrofile (AnexinV+, 7AAD+). To oznaczenie zostanie wykonane dla pacjentów w momencie diagnozy (w stanie aktywnym; BVAS>3) iw momencie remisji.

   Metodologia

   • Neutrofile zostaną wyizolowane z krwi przy użyciu gradientu dekstranu i Ficollu.
   • Badanie ekspresji błonowej PR3, CRT, PLSCR, AxA1 będzie mierzone na wyizolowanych neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej po całonocnej inkubacji w 37°C z oceną apoptozy przez znakowanie aneksyną-V i barwienie 7AAD.

3. Badanie wybuchu oddechowego w neutrofilach pacjentów z GPA Jedną z głównych funkcji neutrofili jest produkcja reaktywnych form tlenu, określimy metabolizm oksydacyjny neutrofili pod wpływem różnych bodźców (f-MLP, opsonizowane kulki zymosanu przez dopełniacz, opsonizowany zymosan kulki przez IgG, PMA) z lub bez uprzedniego primingu przez TNFα.

   Metodologia:

   Eksploracja wybuchu oddechowego zostanie przeprowadzona w pełnej krwi techniką chemiluminescencyjną (luminolową). Neutrofile będą pobudzane przez TNFα lub stymulowane bez primowania. Odpowiedź impulsu będzie analizowana przez 90 minut po stymulacji.

4. Deregulacja cytokinomu neutrofili Neutrofile są zdolne do syntetyzowania dużej liczby cytokin (IL-1, TNFα, IL-6, IL-12), czynników wzrostu, takich jak GM-CSF i chimiokin, takich jak IL-8. Niedawno wykazano, że neutrofile są również świetnymi producentami BAFF (czynnik aktywujący komórki B) i że produkcja jest lepsza niż w monocytach lub komórkach dendrytycznych, gdy są stymulowane przez INF-γ. W GPA wykazano, że poziom BAFF w surowicy jest wyższy niż w grupie kontrolnej, a niedawno w dużych kontrolowanych badaniach potwierdzono znaczenie leków ukierunkowanych na limfocyty B w przypadku AAV.

   Metodologia:

   Surowica pacjentów zostanie pobrana w tym samym czasie co neutrofile. Zostaną one przeanalizowane przy użyciu BD™ Cytometric Bead Array (CBA) z wykrywaniem IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF i IL-12p70. Neutrofile, które zostaną wyizolowane jak w punkcie 1) będą stymulowane przez INF-γ, LPS i G-CSF w celu analizy ich wytwarzania i wydzielania BAFF/BlyS określonego przez ELISA.

5. Deregulacja proteomu neutrofili i badanie funkcjonalne nowych partnerów PR3 Badania z użyciem macierzy genów wykazały prawdopodobną deregulację neutrofili w AAV, w tym badaniu będziemy badać tę deregulację na poziomie białek.

Metodologia:

Aby zbadać proteom pacjenta z GPA, gdy jest aktywny iw stanie remisji, w porównaniu ze zdrowymi kontrolami, użyjemy różnicowej elektroforezy żelowej próbek cytozolowych neutrofili uzyskanych przez sonikację. Identyfikacja białek będących przedmiotem zainteresowania zostanie przeprowadzona za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF. Przeprowadzona zostanie funkcjonalna walidacja tych białek poprzez nadekspresję lub ekstynkcję siRNA.