嚢胞性線維症における分泌型 IgA と粘膜免疫の障害 (Forton2015)

嚢胞性線維症における分泌型 IgA および粘膜免疫の障害:

pIgRを介したIgAトランスサイトーシスの調節におけるCFTR関連の上皮変化の役割と、肺の病理学および細菌感染に対する防御障害への寄与。

プロジェクトの説明 嚢胞性線維症 (CF) は、白人集団で最も一般的な致死性の常染色体劣性疾患であり、主に肺に影響を及ぼします。 この疾患の原因遺伝子が特定されてから 24 年が経過しましたが、多くの疑問が残っています。 これは、気道上皮細胞の頂端膜に発現するタンパク質をコードする嚢胞性線維症膜貫通制御因子 (CFTR) 遺伝子に影響を与え、cAMP 依存性クロライド チャネルおよび上皮 Na+ チャネル (ENaC) を含む他のチャネルの制御因子として機能します。 . CFTR の変異 (F508del、症例の 70%) は、小胞体でのタンパク質のミスフォールディングと保持により、頂端膜での CFTR タンパク質の機能不全または完全な欠如を引き起こします。 それは、上皮内層液の塩化物流出および水和の欠陥をもたらし、気道、腸内腔および腺管（例えば、膵臓）を閉塞する可能性のある異常に粘稠な粘液をもたらす. CFTR の機能不全はまた、上皮の炎症誘発性活性化 (NFkB などによる) を引き起こし、その結果、CXCL8/IL8 が放出され (Sloane et al, 2005)、α-デフェンシンなどの保護因子の産生が損なわれます。 気道の気道コロニー形成と肺感染症は、この疾患の特徴であり、特に緑膿菌 (PA) は CF 患者の 70% に影響を及ぼし、臨床転帰不良と関連しています。 ただし、CF 気道における病原体の持続性の根底にあるメカニズムは、ほとんど不明のままです。

このプロジェクトの目的は、分泌型 IgA (S-IgA) の産生が CF 肺で損なわれるかどうか、どのメカニズムを通じて、この欠陥が PA などの呼吸器病原体に対する免疫保護を損なうことによって CF の病因に寄与するかを調査することです。 S-IgA は、吸入/摂取された抗原および病原体のいわゆる免疫排除による、粘膜防御の主要なラインです (Norderhaug et al, 1999)。 上皮下粘膜形質細胞による高分子 (主に二量体) IgA の合成に続いて、p-IgA は高分子免疫グロブリン受容体 (pIgR) によって媒介される経細胞ルーティングによって上皮を横切って輸送されます。 P-IgA は、上皮の基底外側極で pIgR に結合し、先端極までトランスサイトーシスされます。ここで、タンパク質分解性切断により、分泌成分 (SC) と呼ばれる pIgR の細胞外部分が放出され、p-IgA に結合したままになります。 S-IgA を形成します。 この輸送は、体内で最も重要な経細胞経路を表しています (3g/日)。 S-IgA は主に、上皮細胞および B 細胞上の Toll 様受容体を介して作用する微生物シグナルによる粘膜刺激で生成されます (MacPherson et al, 2008) 一方で、サイトカイン (IFN-g、IL-4、IL-1 または TNF-a) pIgRの発現および/またはトランスサイトーシスをアップレギュレートする可能性があります（Pilette et al、2001aのレビューを参照）。

pIgR 発現の欠陥は、喫煙による慢性閉塞性肺疾患 (COPD) で確認されています (Pilette et al, 2001b)。 COPDにおけるpIgRの減少は、好中球由来のセリンプロテイナーゼによる分解（Pilette et al、2003）、および遺伝子転写の障害（Gohy＆Pilette、投稿原稿）による可能性があります。 COPD とは対照的に、pIgR 発現が CF で影響を受けるかどうか、どのメカニズムを介して影響を受けるか、影響を受ける場合は粘膜防御に関してどのような結果をもたらすかは不明のままです。 私たちの仮説は、CFTR関連の上皮変化の結果として、pIgR発現がCF上皮で減少し、IgAを介した呼吸器病原体の免疫排除の障害につながり、それによってCFでの慢性的な細菌のコロニー形成と肺感染を促進するというものです。 このプロジェクトの具体的な目的は次のとおりです。

1. コントロールと比較して、CF 患者の気管支組織における pIgR & IgA 発現を評価します。 これは、末期肺疾患のCF患者からの肺外植片（KULeuvenから11個、パリから18個、すでに収集されている;対照からの7個の外植片および非喫煙者からの肺外科標本と比較して）および気管支生検の両方で実行されます。 (n=8) および BAL (2x50mL) は、移植前の気管支鏡検査中にサンプリングされました (前向きサンプリング、KULeuven)。 対照被験者は、CFがなく、肺疾患の証拠がなく、独立した理由でKULeuvenセンターで麻酔を受けている患者です。 さらに、一連の喀痰 (CF および対照患者から) も分析されます。 対照被験者は、COPD患者と健康な被験者（喫煙者または非喫煙者）で構成されます。 さらに、肺環境外の粘膜 CF 組織を調査するために、CF からの鼻副鼻腔および直腸の生検も取得されます。 読み出しは、遺伝子 (RT-qPCR) およびタンパク質 (免疫組織化学、ウエスタンブロット) レベルの両方での pIgR 発現、および IgA (免疫組織化学、IgA1 および IgA2 の RT-qPCR) で構成されます。 さらに、気管支洗浄液および喀痰中の (S-)IgA および SC を測定します。

   世界的には、可能であれば、30 個の外植片、30 個の内視鏡検査、および 150 個の喀痰を分析できると予想しました。

2. CF 気道の呼吸器細菌に対する S-IgA 抗体を評価する: CF における S-IgA 欠損症の関連性は、下気道の微生物コロニー形成に関して評価されます。 まず、低い S-IgA レベル (総 IgA と病原体特異的 IgA の両方) と病原体によるコロニー形成 (特に PA) との相関関係を、CF 患者の喀痰および気管支洗浄液でテストします。 さらに、肺外植片では、S-IgA 欠損と PA 染色の間の地域的/空間的関係も取り上げられます。 第二に、PA 特異的 IgA 抗体は、気管支洗浄液および喀痰液でアッセイされ、定着データと関連付けられます。
3. CFTR KO マウスの肺病理に対する S-IgA 欠損の寄与を評価する: CF 肺疾患に対する S-IgA 欠損の潜在的な寄与は、CFTR KO マウスを使用して in vivo で評価されます。 これらの KO マウスはヒトの CF 表現型を再現しないため、LPS への曝露を繰り返すと COPD 様の表現型が生じる (Juanita et al, 2002) - pIgR/SC ダウンレギュレーションをもたらすというパイロット観察を利用します (「得られた結果」）。 したがって、慢性的なLPS曝露により誘発されるpIgR欠乏症が、CFTR KOマウスでCFの特徴を伴う肺病変の発症を促進するかどうかを評価します。 したがって、ダブル (CFTR、pIgR) KO マウスを生成して、CFTR 変異に関連した肺の病理に対する pIgR 欠乏の寄与に直接対処することができます。 さらに、持続性PA感染を模倣する2番目のモデル（Martin et al、2011）を使用して、CFTRおよび/またはpIgR KOマウスにおけるPAの影響に対処します。 Beta-eNaC Tg マウスは、ベースラインの肺の病理を持ち、PA 感染のモデル (マイクロビーズ、Pr Burgel) を取得して感染させることもできます。 読み出しには、組織形態学的および生体分子分析 (炎症およびサイトカイン反応)、および肺機能検査 (FlexiVent) が含まれます。
4. CF 上皮における pIgR ダウンレギュレーションのメカニズムを調査する: CFBE 41o 細胞株 (wt または変異型 F508del CFTR を発現する; Bruscia et al, 2002) は有意なレベルの pIgR を発現しないため (「得られた結果」を参照)、初代ヒト気管支上皮細胞 (HBEC) を使用して、in vitro で培養した CF 上皮で pIgR ダウンレギュレーションが維持されているかどうかを評価します。 HBEC の気液界面 (ALI) での初代培養は、対照と比較して CF 患者から実施されます (COPD の PI の研究室で稼働中のプロトコル。EpithelixR からの細胞も使用されます。また、鼻腔CFからの細胞（de Courcey et al、2012））。 ALI 培養は、LPS および/または IL-1 によって休止または刺激された、分極および再構成された粘膜毛様体気道上皮の細胞機能を評価することを可能にします。 pIgR 発現が in vitro で CF 上皮でも減少する場合、それは CFTR 遺伝子欠損および/または炎症性微小環境による上皮の in vivo インプリンティングの後成的記憶に関連している可能性があります。 したがって、CFTR阻害剤を使用してこれらの可能性を区別します（CFTR-inh172、PPQ-102; Martin et al、2013）。 pIgR 機能不全のもう 1 つの転写後メカニズムには、細胞膜への誤ったアドレッシングが含まれます。 読み出しには、(フィルターの) 免疫染色とウエスタンブロット、および RT-qPCR によって評価された pIgR 発現が含まれます。 pIgR の機能は、ALI 上皮が二量体 IgA を側底から頂端コンパートメントにトランスサイトースする能力を測定することによってテストされます。 CFTR（頂端）およびpIgR（基底）の膜アドレッシングは、共焦点顕微鏡によって研究されます。