낭포성 섬유증에서 손상된 분비 IgA와 점막 면역 (Forton2015)

낭포성 섬유증에서 손상된 분비 IgA 및 점막 면역:

pIgR 매개 IgA transcytosis의 조절에서 CFTR 관련 상피 변화의 역할과 폐 병리학에 대한 기여 및 박테리아 감염에 대한 손상된 방어.

프로젝트 설명 낭포성 섬유증(CF)은 주로 폐에 영향을 미치는 백인 집단에서 가장 흔한 치명적인 상염색체 열성 장애를 나타냅니다. 이 질병의 원인이 되는 유전자가 밝혀진 지 24년이 지났지만 많은 의문이 남아 있습니다. 현재 치료법은 증상이 있고 치명적인 질병으로 남아 있습니다. 이는 기도 상피 세포의 정점 막에서 발현되는 단백질을 암호화하는 낭포성 섬유증 막횡단 조절인자(CFTR) 유전자에 영향을 미치며, 여기서 cAMP 의존성 염화물 채널 및 상피 Na+ 채널(ENaC)을 포함한 다른 채널의 조절인자 역할을 합니다. . CFTR의 돌연변이(F508del, 사례의 70%)는 단백질 잘못 접힘 및 소포체에서의 유지로 인해 정점 막에서 CFTR 단백질의 오작동 또는 완전한 부재를 초래합니다. 그것은 염화물 유출의 결함과 상피내막액의 수화를 초래하여 비정상적으로 점성이 있는 점액을 생성하여 기도, 장 내강 및 선관(예: 췌장)을 막을 수 있습니다. CFTR 기능 장애는 또한 상피의 전염증성 활성화(예: NFkB를 통해)로 이어져 CXCL8/IL8 방출(Sloane et al, 2005) 및 α-데펜신과 같은 보호 인자 생산 장애를 초래합니다. 기도 및 폐 감염의 기도 집락화는 이 질병의 특징이며, 특히 CF 환자의 70%에 영향을 미치고 불량한 임상 결과와 관련된 Pseudomonas aeruginosa(PA)의 특징입니다. 그러나, CF 기도에서 병원균의 지속성의 기본 메커니즘은 대체로 불분명합니다.

이 프로젝트는 분비성 IgA(S-IgA)의 생성이 CF 폐에서 손상되는지, 어떤 메커니즘을 통해 이 결함이 PA와 같은 호흡기 병원체에 대한 면역 보호를 손상시켜 CF의 병인에 기여하는지 여부를 조사하는 것을 목표로 합니다. S-IgA는 흡입/섭취 항원 및 병원체의 소위 면역 배제를 통한 주요 점막 방어선입니다(Norderhaug et al, 1999). 상피하 점막 형질 세포에 의한 고분자(주로 이량체) IgA의 합성 후, p-IgA는 고분자 면역글로불린 수용체(pIgR)에 의해 매개되는 경세포 경로에 의해 상피를 가로질러 수송됩니다. P-IgA는 상피의 기저외측 극에서 pIgR에 결합하고, 단백분해 절단이 pIgR의 세포외 부분을 방출하는 p-IgA에 결합된 상태로 남아 있는 분비 성분(SC)을 방출하는 정단 극까지 트랜스사이토시스됩니다. S-IgA를 형성합니다. 이 수송은 신체에서 가장 중요한 세포간 경로를 나타냅니다(3g/일). S-IgA는 주로 상피 세포와 B 세포(MacPherson et al, 2008)의 Toll 유사 수용체를 통해 작용하는 미생물 신호에 의한 점막 자극 시 생성되는 반면 사이토카인(IFN-g, IL-4, IL-1 또는 TNF-a)은 생성됩니다. pIgR 발현 및/또는 트랜스사이토시스를 상향 조절할 수 있습니다(Pilette et al, 2001a 검토 참조).

연기로 유발된 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에서 pIgR 발현의 결함이 확인되었습니다(Pilette et al, 2001b). COPD에서 감소된 pIgR은 호중구 유래 세린 프로테이나제(Pilette et al, 2003)에 의한 분해와 손상된 유전자 전사(Gohy & Pilette, 원고 제출) 때문일 수 있습니다. COPD와 달리 pIgR 발현이 CF에서 영향을 받는지, 어떤 메커니즘을 통해 영향을 받는지, 그렇다면 점막 방어 측면에서 어떤 결과를 가져오는지는 불분명합니다. 우리의 가설은 CFTR 관련 상피 변화의 결과로 CF 상피에서 pIgR 발현이 감소하고 호흡기 병원체의 IgA 매개 면역 배제 장애로 이어져 CF에서 만성 세균 집락화 및 폐 감염을 선호한다는 것입니다. 이 프로젝트의 구체적인 목표는 다음과 같습니다.

1. 대조군과 비교하여 CF 환자의 기관지 조직에서 pIgR 및 IgA 발현을 평가합니다. 이는 말기 폐 질환이 있는 CF 환자의 폐 외식편(KULeuven에서 11개, 파리에서 18개, 이미 수집됨; 대조군의 7개 외식편 및 비흡연자의 폐 수술 표본과 비교)과 기관지 생검에서 모두 수행될 것입니다. (n=8) 및 BAL(2x50mL)은 이식 전 기관지경 검사(전향적 샘플링, KULeuven) 동안 샘플링되었습니다. 대조군 피험자는 CF가 없고 폐 질환의 증거가 없으며 KULeuven 센터에서 독립적인 이유로 마취를 겪고 있는 환자입니다. 또한 일련의 가래(CF 및 대조군 환자로부터)도 분석됩니다. 제어 대상은 COPD 환자와 건강한 대상(흡연자 여부)으로 구성됩니다. 또한 폐 환경 외부의 점막 CF 조직을 조사하기 위해 CF의 비부비동 및 직장 생검도 얻을 수 있습니다. 판독값은 IgA(면역조직화학, IgA1 및 IgA2에 대한 RT-qPCR)뿐만 아니라 유전자(RT-qPCR) 및 단백질(면역조직화학, 웨스턴 블롯) 수준 모두에서 pIgR 발현으로 구성됩니다. 또한, (S-)IgA 및 SC는 기관지 세척액 및 가래에서 측정됩니다.

   전 세계적으로 가능하면 30개의 외식편, 30개의 내시경, 150개의 가래를 분석할 수 있을 것으로 예상했습니다.

2. CF 기도에서 호흡기 박테리아에 대한 S-IgA 항체를 평가하기 위해: CF에서 S-IgA 결핍의 관련성은 하부 기도의 미생물 집락화와 관련하여 평가됩니다. 첫째, 낮은 S-IgA 수준(총 IgA 및 병원체 특이적 IgA 모두)과 병원체(특히 PA)에 의한 집락화 사이의 상관관계를 CF 환자의 가래 및 기관지 세척액에서 테스트할 것입니다. 또한, 폐 외식편에서 S-IgA 결함과 PA 염색 사이의 지역적/공간적 관계도 다룰 것입니다. 둘째, PA-특이적 IgA 항체는 기관지 세척액 및 가래액에서 분석되고 콜로니화 데이터와 연관됩니다.
3. CFTR KO 마우스에서 폐 병리학에 대한 S-IgA 결함의 기여도를 평가하기 위해: CFTR KO 마우스를 사용하여 S-IgA 결핍이 CF 폐 질환에 미치는 잠재적 기여도를 생체 내에서 평가할 것입니다. 이 KO 생쥐는 인간 CF 표현형을 반복하지 않기 때문에 반복적인 LPS 노출(COPD 유사 표현형(Juanita et al, 2002))이 pIgR/SC 하향 조절을 초래한다는 파일럿 관찰을 활용할 것입니다(" 얻은 결과"). 따라서 우리는 만성 LPS 노출 시 유도된 pIgR 결핍이 CFTR KO 생쥐에서 CF 기능을 가진 폐 병리의 발달을 촉진하는지 여부를 평가할 것입니다. 따라서, 이중(CFTR, pIgR) KO 마우스는 CFTR 돌연변이와 함께 폐 병리학에 대한 pIgR 결핍의 기여를 직접 다루기 위해 생성될 수 있다. 또한 지속적인 PA 감염을 모방한 두 번째 모델(Martin et al, 2011)을 사용하여 CFTR 및/또는 pIgR KO 마우스에서 PA의 영향을 다룰 것입니다. Beta-eNaC Tg 마우스는 기본 폐 병리를 가지고 있으며 PA 감염 모델(마이크로비드, Pr Burgel)에 의해 획득 및 감염될 수도 있습니다. 판독에는 조직 형태학 및 생체분자 분석(염증 및 사이토카인 반응) 및 폐 기능 검사(FlexiVent)가 포함됩니다.
4. CF 상피에서 pIgR 하향 조절의 메커니즘을 탐색하기 위해: CFBE 41o-세포주(wt 또는 돌연변이 F508del CFTR을 발현; Bruscia et al, 2002)는 상당한 수준의 pIgR을 발현하지 않기 때문에("얻은 결과" 참조), 일차 인간 기관지 상피 세포(HBEC)를 사용하여 pIgR 하향조절이 시험관내 배양된 CF 상피에서 유지되는지 여부를 평가할 것입니다. HBEC의 공기-액체 인터페이스(ALI)에서의 1차 배양은 대조군과 비교하여 CF 환자로부터 수행될 것입니다(COPD의 PI 실험실에서 실행 중인 프로토콜; EpithelixR의 세포도 사용됨; 코뿐만 아니라 CF의 세포(de Courcey et al, 2012)). ALI 배양은 LPS 및/또는 IL-1에 의해 휴식 또는 자극된 편광 및 재구성된 점액-섬모 기도 상피에서 세포 기능을 평가할 수 있게 합니다. 시험관 내 CF 상피에서도 pIgR 발현이 감소하는 경우, 이는 CFTR 유전자 결함 및/또는 염증성 미세 환경에 의한 생체 내 상피 각인의 후생유전학적 기억과 관련될 수 있습니다. 따라서 CFTR 억제제를 사용하여 이러한 가능성을 구분할 것입니다(CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). pIgR 기능 장애의 또 다른 전사 후 메커니즘에는 세포막에 대한 잘못된 주소 지정이 포함됩니다. 판독값에는 (필터의) 면역염색 및 웨스턴 블롯 및 RT-qPCR에 의해 평가된 pIgR 발현이 포함됩니다. pIgR의 기능은 ALI 상피가 기저외측에서 정단 구획으로 이량체 IgA를 트랜스사이토시스하는 능력을 측정함으로써 시험될 것이다. CFTR(apical) 및 pIgR(basal)의 멤브레인 어드레싱은 공초점 현미경으로 연구될 것입니다.