Verminderde secretoire IgA en mucosale immuniteit bij cystische fibrose (Forton2015)

Verminderde secretoire IgA en mucosale immuniteit bij cystische fibrose:

rol van CFTR-gerelateerde epitheliale veranderingen in de regulatie van pIgR-gemedieerde IgA-transcytose en bijdrage aan longpathologie en verminderde afweer tegen bacteriële infecties.

PROJECTBESCHRIJVING Cystic fibrosis (CF) vertegenwoordigt de meest voorkomende dodelijke autosomaal recessieve aandoening bij de blanke bevolking en treft voornamelijk de longen. Vierentwintig jaar na de identificatie van het gen dat verantwoordelijk is voor de ziekte, blijven er veel vragen over, de huidige behandelingen zijn symptomatisch en het blijft een dodelijke ziekte. Het beïnvloedt het Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR)-gen, dat codeert voor een eiwit dat tot expressie wordt gebracht op het apicale membraan van luchtwegepitheelcellen, waar het fungeert als een cAMP-afhankelijk chloridekanaal en regulator van andere kanalen, waaronder het epitheliale Na+-kanaal (ENaC). . Mutaties van de CFTR (F508del, 70% van de gevallen) resulteren in een storing of volledige afwezigheid van het CFTR-eiwit bij het apicale membraan, als gevolg van verkeerd gevouwen eiwitten en retentie in het endoplasmatisch reticulum. Het resulteert in defecten in de chloride-efflux en hydratatie van de epitheliale voeringvloeistof, resulterend in abnormaal stroperig slijm dat de luchtwegen, het darmlumen en glandulaire kanalen (bijvoorbeeld in de pancreas) kan verstoppen. CFTR-disfunctie leidt ook tot pro-inflammatoire activering (bijv. via NFkB) van het epitheel, resulterend in CXCL8/IL8-afgifte (Sloane et al, 2005) en verminderde productie van beschermende factoren zoals a-defensinen. Luchtwegkolonisatie van de luchtwegen en longinfecties zijn kenmerkend voor deze ziekte, in het bijzonder Pseudomonas aeruginosa (PA), die 70% van de CF-patiënten treft en gepaard gaat met slechte klinische resultaten. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de persistentie van pathogenen in CF-luchtwegen, blijven echter grotendeels onduidelijk.

Dit project beoogt te onderzoeken of de productie van secretoir IgA (S-IgA) in de CF-long is verstoord, via welke mechanismen, en of dit defect bijdraagt ​​aan de pathogenese van CF door de immuunbescherming tegen respiratoire pathogenen zoals PA te verminderen. S-IgA is een belangrijke lijn van slijmvliesverdediging, door zogenaamde immuunuitsluiting van geïnhaleerde / ingenomen antigenen en pathogenen (Norderhaug et al, 1999). Na de synthese van polymeer (voornamelijk dimeer) IgA door subepitheliale mucosale plasmacellen, wordt p-IgA door het epitheel getransporteerd via een transcellulaire route die wordt gemedieerd door de polymere immunoglobulinereceptor (pIgR). P-IgA bindt zich aan de pIgR aan de basolaterale pool van het epitheel, en wordt getranscytoteerd tot aan de apicale pool, waar een proteolytische splitsing het extracellulaire deel van de pIgR vrijgeeft, secretoire component (SC) genaamd, dat gebonden blijft aan p-IgA om vormen S-IgA. Dit transport vertegenwoordigt de belangrijkste transcellulaire route in het lichaam (3g/dag). S-IgA wordt voornamelijk geproduceerd na mucosale stimulatie door microbiële signalen die werken via Toll-achtige receptoren op epitheelcellen en B-cellen (MacPherson et al, 2008) terwijl cytokines (IFN-g, IL-4, IL-1 of TNF-a) kan pIgR-expressie en/of transcytose opwaarts reguleren (zie review Pilette et al, 2001a).

Een defect van pIgR-expressie is geïdentificeerd bij door rook veroorzaakte chronische obstructieve longziekte (COPD) (Pilette et al, 2001b). Verminderde pIgR bij COPD kan het gevolg zijn van afbraak door van neutrofielen afgeleide serineproteïnasen (Pilette et al, 2003), evenals van verminderde gentranscriptie (Gohy & Pilette, ingediend manuscript). In tegenstelling tot COPD blijft het onduidelijk of pIgR-expressie wordt beïnvloed bij CF, via welke mechanismen, en zo ja, met welke gevolgen in termen van mucosale verdediging. Onze hypothese is dat pIgR-expressie verminderd is in CF-epitheel, als gevolg van CFTR-gerelateerde epitheelveranderingen, en leidt tot verminderde IgA-gemedieerde immuunuitsluiting van respiratoire pathogenen, waardoor chronische bacteriële kolonisatie en longinfecties bij CF worden bevorderd. De specifieke doelstellingen van dit project zijn als volgt:

1. om pIgR & IgA-expressie in bronchiaal weefsel van CF-patiënten te evalueren, in vergelijking met controles. Dit zal zowel worden uitgevoerd in longexplantaten van CF-patiënten met eindstadium longziekte (11 van de KULeuven en 18 van Parijs, reeds verzameld; in vergelijking met 7 explantaten van controles en longchirurgische specimens van niet-rokers) als in bronchiale biopsieën. (n=8) en BAL (2x50mL) bemonsterd tijdens pre-transplantatie bronchoscopieën (prospectieve bemonstering, KULeuven). Controlepersonen zullen patiënten zijn zonder CF en zonder bewijs van longziekte en die om een ​​onafhankelijke reden een narcose ondergaan in het KULeuven centrum. Daarnaast zal ook een reeks sputum (van CF- en controlepatiënten) worden geanalyseerd. Controlepersonen zullen bestaan ​​uit COPD-patiënten en gezonde proefpersonen (rokers of niet). Bovendien zullen ook nasosinusale en rectale biopsieën van CF worden verkregen, om mucosale CF-weefsels buiten de longomgeving te onderzoeken. Uitlezingen zullen bestaan ​​uit pIgR-expressie op zowel gen- (RT-qPCR) als eiwit- (immunohistochemie, western blot) niveaus, evenals voor IgA (immunohistochemie, RT-qPCR voor IgA1 en IgA2). Daarnaast zullen (S-)IgA en SC gemeten worden in bronchiale lavagevloeistoffen en in sputum.

   Wereldwijd verwachtten we indien mogelijk 30 explantaten, 30 endoscopieën en 150 sputum te analyseren.

2. om S-IgA-antilichamen tegen respiratoire bacteriën in CF-luchtwegen te evalueren: De relevantie van S-IgA-deficiëntie bij CF zal worden beoordeeld met betrekking tot microbiële kolonisatie van lagere luchtwegen. Ten eerste zal de correlatie tussen lage S-IgA-niveaus (zowel totaal IgA als pathogeenspecifiek IgA) en kolonisatie door pathogenen - in het bijzonder PA - worden getest in sputum en bronchiale lavagevloeistoffen van CF-patiënten. Daarnaast zal in longexplantaten ook een regionale/ruimtelijke relatie tussen S-IgA-defect en PA-kleuring worden onderzocht. Ten tweede zullen PA-specifieke IgA-antilichamen worden getest in bronchiale lavage en sputumvloeistoffen, en gecorreleerd met kolonisatiegegevens.
3. om de bijdrage van S-IgA-defect aan longpathologie in CFTR KO-muizen te evalueren: De potentiële bijdrage van S-IgA-deficiëntie aan CF-longziekte zal in vivo worden beoordeeld met behulp van CFTR KO-muizen. Aangezien deze KO-muizen het menselijke CF-fenotype niet recapituleren, zullen we profiteren van onze proefobservatie dat herhaalde LPS-blootstelling - wat leidt tot een COPD-achtig fenotype (Juanita et al, 2002) - resulteert in pIgR/SC-downregulatie (zie " Verkregen resultaten"). We zullen dus evalueren of pIgR-deficiëntie geïnduceerd na chronische LPS-blootstelling bij CFTR KO-muizen de ontwikkeling van een longpathologie met CF-kenmerken bevordert. Dienovereenkomstig zouden dubbele (CFTR, pIgR) KO-muizen kunnen worden gegenereerd om direct de bijdrage van pIgR-deficiëntie aan longpathologie in combinatie met CFTR-mutatie aan te pakken. Bovendien zal een tweede model dat aanhoudende PA-infectie nabootst (Martin et al, 2011) worden gebruikt om de effecten van PA in CFTR- en/of pIgR KO-muizen aan te pakken. Beta-eNaC Tg-muizen hebben een basislijn longpathologie en kunnen ook worden verkregen en geïnfecteerd door een model van PA-infectie (microbeads, Pr Burgel). Uitlezingen omvatten histomorfologische en biomoleculaire analyses (ontstekings- en cytokinereacties) en longfunctietesten (FlexiVent).
4. om mechanismen van pIgR-downregulatie in het CF-epitheel te onderzoeken: aangezien CFBE 41o-cellijn (die wt of mutant F508del CFTR tot expressie brengt; Bruscia et al, 2002) geen significante niveaus van pIgR tot expressie brengen (zie "Verkregen resultaten"), primair humaan bronchiaal epitheel cellen (HBEC) zullen worden gebruikt om te beoordelen of pIgR-downregulatie wordt gehandhaafd in het in vitro gekweekte CF-epitheel. Primaire culturen in lucht-vloeistofinterface (ALI) van HBEC zullen worden uitgevoerd bij CF-patiënten, in vergelijking met controles (up-and-running protocol in het laboratorium van de PI in COPD; cellen van EpithelixR zullen ook worden gebruikt; evenals nasale cellen van CF (de Courcey et al, 2012)). ALI-culturen maken het mogelijk cellulaire functies te evalueren in een gepolariseerd en gereconstitueerd muco-ciliair luchtwegepitheel, in rust of gestimuleerd door LPS en/of IL-1. Als pIgR-expressie ook in vitro in het CF-epitheel is verlaagd, kan dit verband houden met ofwel het CFTR-gendefect en/of het epigenetische geheugen van de in vivo inprenting van het epitheel door de inflammatoire micro-omgeving. We zullen deze mogelijkheden dus onderscheiden door gebruik te maken van CFTR-remmers (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). Een ander post-transcriptioneel mechanisme van pIgR-disfunctie is de verkeerde adressering naar het celmembraan: de relatie tussen verstoorde expressie van elke receptor (apicale CFTR, basale pIgR) zal worden geëvalueerd. Uitlezingen omvatten pIgR-expressie beoordeeld door immunokleuring (van filters) en western blot, en door RT-qPCR. De functie van de pIgR zal worden getest door het vermogen van het ALI-epitheel te meten om dimeer IgA van het basolaterale naar het apicale compartiment te transcytiseren. Membraanadressering van CFTR (apicaal) en pIgR (basaal) zal bestudeerd worden door middel van confocale microscopie.