Upośledzona wydzielnicza IgA i odporność błony śluzowej w mukowiscydozie (Forton2015)

Upośledzona wydzielnicza IgA i odporność błony śluzowej w mukowiscydozie:

rola zmian nabłonkowych związanych z CFTR w regulacji transcytozy IgA zależnej od pIgR oraz udział w patologii płuc i upośledzeniu obrony przed infekcjami bakteryjnymi.

OPIS PROJEKTU Mukowiscydoza (CF) jest najczęstszą śmiertelną chorobą autosomalną recesywną w populacji białej, dotykającą głównie płuc. Dwadzieścia cztery lata po zidentyfikowaniu genu odpowiedzialnego za chorobę pozostaje wiele pytań, obecne metody leczenia są objawowe, a choroba pozostaje śmiertelna. Wpływa na gen regulatora przezbłonowego mukowiscydozy (CFTR), który koduje białko ulegające ekspresji na błonie wierzchołkowej komórek nabłonka dróg oddechowych, gdzie działa jako zależny od cAMP kanał chlorkowy i regulator innych kanałów, w tym nabłonkowego kanału Na+ (ENaC) . Mutacje CFTR (F508del, 70% przypadków) skutkują nieprawidłowym działaniem lub całkowitym brakiem białka CFTR w błonie wierzchołkowej, z powodu nieprawidłowego fałdowania białka i zatrzymania w retikulum endoplazmatycznym. Powoduje defekty w wypływie chlorków i uwodnieniu płynu wyściełającego nabłonek, co skutkuje nienormalnie lepkim śluzem, który może blokować drogi oddechowe, światło jelita i przewody gruczołowe (np. w trzustce). Dysfunkcja CFTR prowadzi również do aktywacji prozapalnej (np. przez NFkB) nabłonka, co skutkuje uwalnianiem CXCL8/IL8 (Sloane i in., 2005) i upośledzoną produkcją czynników ochronnych, takich jak α-defensyny. Kolonizacja dróg oddechowych i infekcje płuc są cechą charakterystyczną tej choroby, w szczególności Pseudomonas aeruginosa (PA), która dotyka 70% pacjentów z mukowiscydozą i wiąże się ze złymi wynikami klinicznymi. Jednak mechanizmy leżące u podstaw utrzymywania się patogenów w drogach oddechowych mukowiscydozy pozostają w dużej mierze niejasne.

Celem tego projektu jest zbadanie, czy produkcja wydzielniczej IgA (S-IgA) jest upośledzona w płucach mukowiscydozy, poprzez jakie mechanizmy i czy defekt ten przyczynia się do patogenezy mukowiscydozy poprzez upośledzenie ochrony immunologicznej przed patogenami układu oddechowego, takimi jak PA. S-IgA jest główną linią obrony błony śluzowej, poprzez tak zwane wykluczenie immunologiczne wdychanych/połykanych antygenów i patogenów (Norderhaug i in., 1999). Po syntezie polimerycznej (głównie dimerycznej) IgA przez podnabłonkowe komórki plazmatyczne błony śluzowej, p-IgA jest transportowana przez nabłonek na drodze transkomórkowej, w której pośredniczy polimeryczny receptor immunoglobuliny (pIgR). P-IgA wiąże się z pIgR na bocznym biegunie podstawnym nabłonka i ulega transcytozie aż do bieguna wierzchołkowego, gdzie w wyniku cięcia proteolitycznego uwalnia zewnątrzkomórkową część pIgR, zwaną składnikiem wydzielniczym (SC), która pozostaje związana z p-IgA do tworzą S-IgA. Transport ten reprezentuje najważniejsze transkomórkowe prowadzenie w organizmie (3 g/dzień). S-IgA jest wytwarzana głównie po stymulacji błony śluzowej przez sygnały drobnoustrojów działające przez receptory Toll-podobne na komórkach nabłonka i komórkach B (MacPherson i in., 2008), podczas gdy cytokiny (IFN-g, IL-4, IL-1 lub TNF-a) może zwiększać ekspresję pIgR i/lub transcytozę (patrz przegląd Pilette i in., 2001a).

Defekt ekspresji pIgR został zidentyfikowany w wywołanej dymem tytoniowym przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP) (Pilette i in., 2001b). Zmniejszona pIgR w POChP może być spowodowana degradacją przez proteinazy serynowe pochodzące z neutrofili (Pilette i in., 2003), jak również z upośledzoną transkrypcją genów (Gohy i Pilette, przedłożony manuskrypt). W przeciwieństwie do POChP, pozostaje niejasne, czy ekspresja pIgR jest zaburzona w mukowiscydozie, poprzez jakie mechanizmy, a jeśli tak, to z jakimi konsekwencjami w zakresie obrony śluzówki. Nasza hipoteza jest taka, że ​​ekspresja pIgR jest zmniejszona w nabłonku mukowiscydozy w wyniku zmian nabłonkowych związanych z CFTR i prowadzi do upośledzonego wykluczenia immunologicznego patogenów układu oddechowego, w którym pośredniczy IgA, sprzyjając w ten sposób przewlekłej kolonizacji bakteryjnej i infekcjom płuc w mukowiscydozie. Szczegółowe cele tego projektu są następujące:

1. do oceny ekspresji pIgR i IgA w tkance oskrzelowej pacjentów z mukowiscydozą w porównaniu z grupą kontrolną. Zostanie to wykonane zarówno na eksplantatach płuc od pacjentów z mukowiscydozą ze schyłkową chorobą płuc (11 z KULeuven i 18 z Paryża, już pobranych; w porównaniu z 7 eksplantatami z kontroli i próbkami chirurgicznymi płuc od osób niepalących) oraz w biopsjach oskrzeli (n=8) i BAL (2x50mL) pobranych podczas bronchoskopii przedtransplantacyjnej (prospektywne pobieranie próbek, KULeuven). Osobnikami kontrolnymi będą pacjenci bez mukowiscydozy i bez objawów choroby płuc, którzy są poddawani narkozie z niezależnego powodu w ośrodku KULeuven. Ponadto przeanalizowana zostanie również seria plwociny (od pacjentów z mukowiscydozą iz grupy kontrolnej). Osoby kontrolne będą składać się z pacjentów z POChP i osób zdrowych (palących lub nie). Ponadto pobrane zostaną biopsje nosowo-nosowe i odbytnicze z mukowiscydozy w celu zbadania tkanek mukowiscydozy błony śluzowej poza środowiskiem płuc. Odczyty będą obejmować ekspresję pIgR zarówno na poziomie genu (RT-qPCR), jak i białka (immunohistochemia, western blot), a także IgA (immunohistochemia, RT-qPCR dla IgA1 i IgA2). Ponadto w płynach z popłuczyn oskrzelowych iw plwocinie zostaną zmierzone (S-)IgA i SC.

   Globalnie spodziewaliśmy się, że jeśli to możliwe, przeanalizujemy 30 eksplantów, 30 endoskopii i 150 plwociny.

2. ocena przeciwciał S-IgA przeciwko bakteriom układu oddechowego w drogach oddechowych z mukowiscydozą: znaczenie niedoboru S-IgA w mukowiscydozie zostanie ocenione w odniesieniu do kolonizacji przez drobnoustroje dolnych dróg oddechowych. Po pierwsze, w plwocinie i popłuczynach oskrzelowych pacjentów z mukowiscydozą zostanie zbadana korelacja między niskimi poziomami S-IgA (zarówno całkowitym IgA, jak i IgA swoistym dla patogenu) a kolonizacją przez patogeny - w szczególności PA - w plwocinie i popłuczynach oskrzelowych. Ponadto w eksplantatach płuc zostanie również omówiony związek regionalny/przestrzenny między defektem S-IgA a barwieniem PA. Po drugie, przeciwciała IgA swoiste dla PA będą oznaczane w popłuczynach oskrzelowych i plwocinie oraz skorelowane z danymi dotyczącymi kolonizacji.
3. do oceny udziału defektu S-IgA w patologii płuc u myszy CFTR KO: Potencjalny udział niedoboru S-IgA w chorobie płuc CF zostanie oceniony in vivo przy użyciu myszy CFTR KO. Ponieważ te myszy KO nie rekapitulują ludzkiego fenotypu CF, skorzystamy z naszej pilotażowej obserwacji, że powtarzająca się ekspozycja na LPS – która prowadzi do fenotypu podobnego do POChP (Juanita i in., 2002) – skutkuje obniżeniem poziomu pIgR/SC (patrz „ Otrzymane wyniki"). Ocenimy zatem, czy niedobór pIgR wywołany przewlekłą ekspozycją na LPS sprzyja rozwojowi patologii płuc z cechami CF u myszy CFTR KO. W związku z tym można wygenerować podwójne (CFTR, pIgR) myszy KO, aby bezpośrednio zająć się wkładem niedoboru pIgR w patologię płuc w połączeniu z mutacją CFTR. Ponadto drugi model naśladujący uporczywą infekcję PA (Martin i in., 2011) zostanie wykorzystany do zajęcia się skutkami PA u myszy CFTR i / lub pIgR KO. Myszy Beta-eNaC Tg mają wyjściową patologię płuc i można je również uzyskać i zainfekować modelem infekcji PA (mikrokulki, Pr Burgel). Odczyty będą obejmować analizy histomorfologiczne i biomolekularne (odpowiedzi zapalne i cytokinowe) oraz testy czynnościowe płuc (FlexiVent).
4. w celu zbadania mechanizmów obniżania poziomu pIgR w nabłonku CF: Ponieważ linia komórkowa CFBE 41o (eksprymująca wt lub zmutowanego F508del CFTR; Bruscia i in., 2002) nie wykazuje ekspresji znaczących poziomów pIgR (patrz „Otrzymane wyniki”), pierwotny ludzki nabłonek oskrzeli komórki (HBEC) zostaną użyte do oceny, czy obniżenie poziomu pIgR jest utrzymywane w nabłonku CF hodowanym in vitro. Hodowle pierwotne na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) HBEC będą prowadzone od pacjentów z mukowiscydozą w porównaniu z grupą kontrolną (aktualny protokół w laboratorium PI w POChP; zostaną również użyte komórki z EpithelixR; podobnie jak komórki CF (de Courcey i in., 2012)). Hodowle ALI umożliwiają ocenę funkcji komórkowych w spolaryzowanym i odtworzonym nabłonku śluzowo-rzęskowym dróg oddechowych, spoczynkowym lub stymulowanym przez LPS i/lub IL-1. Jeśli ekspresja pIgR jest również zmniejszona w nabłonku CF in vitro, może to być związane albo z defektem genu CFTR i/lub z pamięcią epigenetyczną imprintingu in vivo nabłonka przez mikrośrodowisko zapalne. W ten sposób rozróżnimy te możliwości, stosując inhibitory CFTR (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin i in., 2013). Innym potranskrypcyjnym mechanizmem dysfunkcji pIgR jest jego nieprawidłowe adresowanie do błony komórkowej: zostanie oceniony związek między zaburzoną ekspresją każdego receptora (apical CFTR, basal pIgR). Odczyty będą obejmować ekspresję pIgR ocenianą przez barwienie immunologiczne (filtrów) i western blot oraz przez RT-qPCR. Funkcja pIgR będzie testowana przez pomiar zdolności nabłonka ALI do transcytozy dimerycznej IgA od przedziału podstawno-bocznego do wierzchołkowego. Adresowanie błonowe CFTR (wierzchołkowy) i pIgR (podstawowy) będzie badane za pomocą mikroskopii konfokalnej.