Porucha sekrečního IgA a slizniční imunita u cystické fibrózy (Forton2015)

Porucha sekrečního IgA a slizniční imunity u cystické fibrózy:

role epiteliálních změn souvisejících s CFTR v regulaci transcytózy IgA zprostředkované plgR a příspěvek k plicní patologii a zhoršené obraně proti bakteriálním infekcím.

POPIS PROJEKTU Cystická fibróza (CF) představuje nejčastější letální autozomálně recesivní onemocnění v bílé populaci, postihující především plíce. Dvacet čtyři let po identifikaci genu odpovědného za onemocnění zůstává mnoho otázek, současná léčba je symptomatická a zůstává smrtelným onemocněním. Ovlivňuje gen transmembránového regulátoru cystické fibrózy (CFTR), který kóduje protein exprimovaný na apikální membráně epiteliálních buněk dýchacích cest, kde působí jako cAMP-dependentní chloridový kanál a regulátor dalších kanálů, včetně epiteliálního Na+ kanálu (ENaC). . Mutace CFTR (F508del, 70 % případů) buď vedou k nesprávné funkci nebo úplné absenci proteinu CFTR na apikální membráně v důsledku nesprávného skládání proteinu a jeho zadržování v endoplazmatickém retikulu. To vede k poruchám odtoku chloridů a hydrataci tekutiny epiteliální výstelky, což vede k abnormálně viskóznímu hlenu, který může ucpat dýchací cesty, lumen střeva a žlázové vývody (např. ve slinivce břišní). Dysfunkce CFTR také vede k prozánětlivé aktivaci (např. prostřednictvím NFkB) epitelu, což má za následek uvolnění CXCL8/IL8 (Sloane et al, 2005) a zhoršenou produkci ochranných faktorů, jako jsou a-defensiny. Kolonizace dýchacích cest dýchacích cest a plicní infekce jsou charakteristickým znakem tohoto onemocnění, zejména Pseudomonas aeruginosa (PA), která postihuje 70 % pacientů s CF a je spojena se špatnými klinickými výsledky. Mechanismy, které jsou základem perzistence patogenů v dýchacích cestách s CF, však zůstávají do značné míry nejasné.

Tento projekt si klade za cíl zjistit, zda je produkce sekrečního IgA (S-IgA) v plicích s CF narušena, jakými mechanismy, a zda tento defekt přispívá k patogenezi CF zhoršením imunoprotekce proti respiračním patogenům, jako je PA. S-IgA je hlavní linií slizniční obrany prostřednictvím tzv. imunitního vyloučení vdechnutých / požitých antigenů a patogenů (Norderhaug et al, 1999). Po syntéze polymerního (hlavně dimerního) IgA subepiteliálními slizničními plazmatickými buňkami je p-IgA transportován přes epitel transcelulární cestou zprostředkovanou polymerním imunoglobulinovým receptorem (pIgR). P-IgA se váže na pIgR na bazolaterálním pólu epitelu a je transcytován až k apikálnímu pólu, kde proteolytickým štěpením dojde k uvolnění extracelulární části pIgR, nazývané sekreční složka (SC), která zůstává navázána na p-IgA formě S-IgA. Tento transport představuje nejdůležitější transcelulární cestu v těle (3 g/den). S-IgA je produkován hlavně při slizniční stimulaci mikrobiálními signály působícími prostřednictvím Toll-like receptorů na epiteliálních buňkách a B buňkách (MacPherson et al, 2008), zatímco cytokiny (IFN-g, IL-4, IL-1 nebo TNF-a) může upregulovat expresi pIgR a/nebo transcytózu (viz přehled Pilette et al, 2001a).

Defekt exprese pIgR byl identifikován u kouřem indukované chronické obstrukční plicní nemoci (COPD) (Pilette et al, 2001b). Snížený pIgR u CHOPN by mohl být způsoben degradací serinovými proteinázami odvozenými z neutrofilů (Pilette et al, 2003) a také narušenou genovou transkripcí (Gohy & Pilette, předložený rukopis). Na rozdíl od CHOPN zůstává nejasné, zda je u CF ovlivněna exprese pIgR, jakými mechanismy, a pokud ano, s jakými důsledky z hlediska slizniční obrany. Naší hypotézou je, že exprese pIgR je v CF epitelu snížena v důsledku epiteliálních změn souvisejících s CFTR a vede k narušené IgA zprostředkované imunitní exkluzi respiračních patogenů, čímž podporuje chronickou bakteriální kolonizaci a plicní infekce u CF. Konkrétní cíle tohoto projektu jsou následující:

1. k vyhodnocení exprese pIgR & IgA v bronchiální tkáni pacientů s CF ve srovnání s kontrolami. To bude provedeno jak u plicních explantátů od pacientů s CF s plicním onemocněním v konečném stádiu (11 z KULeuven a 18 z Paříže, již odebráno; ve srovnání se 7 explantáty z kontrol a se vzorky z plicních chirurgických zákroků od nekuřáků), tak v bronchiálních biopsiích (n=8) a BAL (2x50 ml) odebrané během předtransplantačních bronchoskopií (prospektivní odběr, KULeuven). Kontrolními subjekty budou pacienti bez CF a bez průkazu plicního onemocnění, kteří podstupují narkózu z nezávislého důvodu v centru KULeuven. Kromě toho bude také analyzována řada sputa (od pacientů s CF a kontrolních pacientů). Kontrolní subjekty se budou skládat z pacientů s CHOPN a zdravých subjektů (kuřáků nebo nekuřáků). Kromě toho budou také získány nasosinusální a rektální biopsie z CF, aby bylo možné prozkoumat slizniční CF tkáně mimo plicní prostředí. Odečty se budou skládat z exprese pIgR na úrovni genu (RT-qPCR) a proteinu (imunohistochemie, western blot) a také pro IgA (imunohistochemie, RT-qPCR pro IgA1 a IgA2). Kromě toho budou měřeny (S-)IgA a SC v tekutinách z průduškové laváže a ve sputu.

   Globálně jsme očekávali, že pokud to bude možné, analyzujeme 30 explantátů, 30 endoskopií a 150 sputa.

2. vyhodnotit S-IgA protilátky proti respiračním bakteriím v CF dýchacích cestách: Relevance deficitu S-IgA u CF bude posouzena s ohledem na mikrobiální kolonizaci dolních cest dýchacích. Nejprve bude testována korelace mezi nízkými hladinami S-IgA (celkové IgA i IgA specifické pro patogeny) a kolonizací patogeny - zejména PA - ve sputu a tekutinách z výplachu průdušek pacientů s CF. Navíc u plicních explantátů bude také řešen regionální/prostorový vztah mezi defektem S-IgA a barvením PA. Za druhé, PA-specifické IgA protilátky budou testovány v bronchiální laváži a tekutinách sputa a korelovány s údaji o kolonizaci.
3. vyhodnotit příspěvek defektu S-IgA k plicní patologii u myší CFTR KO: Potenciální příspěvek deficitu S-IgA k plicnímu onemocnění CF bude hodnocen in vivo pomocí myší CFTR KO. Protože tyto KO myši nerekapitulují lidský fenotyp CF, využijeme našeho pilotního pozorování, že opakovaná expozice LPS – která vede k fenotypu podobnému CHOPN (Juanita et al, 2002) – vede k downregulaci pIgR/SC (viz " Získané výsledky"). Budeme tedy hodnotit, zda nedostatek plgR indukovaný po chronické expozici LPS podporuje u CFTR KO myší rozvoj plicní patologie s CF rysy. V souladu s tím by mohly být vytvořeny dvojité (CFTR, plgR) KO myši, které by přímo řešily příspěvek nedostatku plgR k plicní patologii ve spojení s mutací CFTR. Kromě toho bude k řešení účinků PA u CFTR a/nebo pIgR KO myší použit druhý model napodobující perzistentní infekci PA (Martin et al, 2011). Beta-eNaC Tg myši mají základní plicní patologii a mohly být také získány a infikovány modelem PA infekce (microbeads, Pr Burgel). Výstupy budou zahrnovat histomorfologické a biomolekulární analýzy (zánětlivé a cytokinové reakce) a funkční testy plic (FlexiVent).
4. prozkoumat mechanismy downregulace pIgR v epitelu CF: Protože buněčná linie CFBE 41o (exprimující wt nebo mutantní F508del CFTR; Bruscia et al, 2002) neexprimuje významné hladiny pIgR (viz „Získané výsledky“), primárního lidského bronchiálního epitelu Buňky HBEC (HBEC) budou použity k posouzení, zda je downregulace plgR udržována v CF epitelu kultivovaném in vitro. Primární kultury na rozhraní vzduch-kapalina (ALI) HBEC budou provedeny u pacientů s CF ve srovnání s kontrolami (protokol v laboratoři PI pro CHOPN; budou také použity buňky z EpithelixR; stejně jako nazální buňky z CF (de Courcey et al, 2012)). Kultury ALI umožňují vyhodnocení buněčných funkcí v polarizovaném a rekonstituovaném mukociliárním epitelu dýchacích cest, buď v klidu nebo stimulovaném LPS a/nebo IL-1. Pokud je exprese pIgR také snížena v epitelu CF in vitro, mohlo by to souviset buď s defektem genu CFTR a/nebo s epigenetickou pamětí in vivo imprintingu epitelu zánětlivým mikroprostředím. Tyto možnosti tedy odlišíme použitím inhibitorů CFTR (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). Dalším post-transkripčním mechanismem dysfunkce plgR je jeho chybné adresování na buněčnou membránu: bude hodnocen vztah mezi narušenou expresí každého receptoru (apikální CFTR, bazální pIgR). Odečet bude zahrnovat expresi plgR hodnocenou imunobarvením (filtrů) a western blotem a pomocí RT-qPCR. Funkce pIgR bude testována měřením kapacity epitelu ALI transcytózou dimerního IgA z bazolaterálního do apikálního kompartmentu. Membránové adresování CFTR (apikální) a pIgR (bazální) bude studováno konfokální mikroskopií.