Nedsatt sekretorisk IgA och mukosal immunitet vid cystisk fibros (Forton2015)

Nedsatt sekretorisk IgA och mukosal immunitet vid cystisk fibros:

roll av CFTR-relaterade epitelförändringar i regleringen av pIgR-medierad IgA-transcytos och bidrag till lungpatologi och försämrat försvar mot bakterieinfektioner.

PROJEKTBESKRIVNING Cystisk fibros (CF) representerar den vanligaste dödliga autosomala recessiva störningen i den vita befolkningen, som främst drabbar lungorna. Tjugofyra år efter identifieringen av den gen som är ansvarig för sjukdomen återstår många frågor, nuvarande behandlingar är symtomatiska och det är fortfarande en dödlig sjukdom. Det påverkar genen Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR), som kodar för ett protein som uttrycks på det apikala membranet av luftvägsepitelceller, där det fungerar som en cAMP-beroende kloridkanal och regulator av andra kanaler, inklusive den epiteliala Na+-kanalen (ENaC) . Mutationer av CFTR (F508del, 70 % av fallen) resulterar antingen i funktionsfel eller fullständig frånvaro av CFTR-proteinet vid det apikala membranet, på grund av felveckning av protein och retention i det endoplasmatiska retikulumet. Det resulterar i defekter i kloridutflödet och hydrering av epitelslemhinnan, vilket resulterar i onormalt trögflytande slem som kan blockera luftvägarna, tarmens lumen och körtelkanalerna (t.ex. i bukspottkörteln). CFTR-dysfunktion leder också till pro-inflammatorisk aktivering (t.ex. genom NFkB) av epitelet, vilket resulterar i CXCL8/IL8-frisättning (Sloane et al, 2005) och försämrad produktion av skyddande faktorer såsom a-defensiner. Kolonisering av luftvägarna och lunginfektioner är ett kännetecken för denna sjukdom, särskilt med Pseudomonas aeruginosa (PA) som drabbar 70 % av CF-patienterna och är associerad med dåliga kliniska resultat. Men de mekanismer som ligger till grund för patogenernas persistens i CF-luftvägarna är fortfarande i stort sett oklara.

Detta projekt syftar till att undersöka om produktionen av sekretoriskt IgA (S-IgA) är försämrad i CF-lungan, genom vilka mekanismer, och om denna defekt bidrar till patogenesen av CF genom att försämra immunskyddet mot luftvägspatogener såsom PA. S-IgA är en viktig linje för slemhinneförsvar, genom så kallad immunuteslutning av inhalerade/intagna antigener och patogener (Norderhaug et al, 1999). Efter syntes av polymert (huvudsakligen dimert) IgA av subepiteliala mukosala plasmaceller, transporteras p-IgA över epitelet genom en transcellulär routing medierad av den polymera immunglobulinreceptorn (pIgR). P-IgA binder till pIgR vid epitelets basolaterala pol, och transcytoseras upp till den apikala polen, där en proteolytisk klyvning frisätter den extracellulära delen av pIgR, kallad sekretorisk komponent (SC) som förblir bunden till p-IgA till bildar S-IgA. Denna transport representerar den viktigaste transcellulära routingen i kroppen (3g/dag). S-IgA produceras huvudsakligen vid mukosal stimulering av mikrobiella signaler som verkar genom Toll-liknande receptorer på epitelceller och B-celler (MacPherson et al, 2008) medan cytokiner (IFN-g, IL-4, IL-1 eller TNF-a) kan uppreglera pIgR-uttryck och/eller transcytos (se översikt Pilette et al, 2001a).

En defekt i pIgR-uttryck har identifierats vid rökinducerad kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) (Pilette et al, 2001b). Minskad pIgR vid KOL kan bero på nedbrytning av neutrofilhärledda serinproteinaser (Pilette et al, 2003), såväl som på försämrad gentranskription (Gohy & Pilette, inlämnat manuskript). Till skillnad från KOL är det fortfarande oklart om pIgR-uttrycket påverkas i CF, genom vilka mekanismer och i så fall med vilka konsekvenser i termer av slemhinneförsvar. Vår hypotes är att pIgR-uttryck reduceras i CF-epitel, som ett resultat av CFTR-relaterade epitelförändringar, och leder till försämrad IgA-medierad immunexklusion av respiratoriska patogener, vilket gynnar kronisk bakteriell kolonisering och lunginfektioner i CF. De specifika målen för detta projekt är följande:

1. för att utvärdera pIgR & IgA-uttryck i bronkial vävnad från CF-patienter, jämfört med kontroller. Detta kommer att utföras både i lungexplantat från CF-patienter med lungsjukdom i slutstadiet (11 från KULeuven och 18 från Paris, redan insamlade; jämfört med 7 explantat från kontroller och till lungkirurgiska prover från icke-rökare) och i bronkialbiopsier (n=8) och BAL (2x50mL) provtagna under pre-transplantation bronkoskopier (prospektiv provtagning, KULeuven). Kontrollpersoner kommer att vara patienter utan CF och utan tecken på lungsjukdom och som genomgår narkos av oberoende anledning vid KULeuven-centrum. Dessutom kommer en serie sputum (från CF och kontrollpatienter) också att analyseras. Kontrollpersoner kommer att bestå av KOL-patienter och friska försökspersoner (rökare eller inte). Dessutom kommer nasosinusala och rektala biopsier från CF också att tas för att undersöka mukosala CF-vävnader utanför lungmiljön. Avläsningarna kommer att bestå av pIgR-uttryck på både gen- (RT-qPCR) och protein- (immunhistokemi, western blot) nivåer, såväl som för IgA (immunohistokemi, RT-qPCR för IgA1 och IgA2). Dessutom kommer (S-)IgA och SC att mätas i bronkial lavage-vätskor och i sputum.

   Globalt förväntade vi oss om möjligt att analysera 30 explantat, 30 endoskopier och 150 sputum.

2. för att utvärdera S-IgA-antikroppar mot luftvägsbakterier i CF-luftvägar: Relevansen av S-IgA-brist vid CF kommer att bedömas med avseende på mikrobiell kolonisering av nedre luftvägar. Först kommer korrelation mellan låga S-IgA-nivåer (både totalt IgA och patogenspecifik IgA) och kolonisering av patogener - i synnerhet PA - att testas i sputum och bronkialsköljvätskor från CF-patienter. Dessutom kommer ett regionalt/spatialt samband mellan S-IgA-defekt och PA-färgning också att tas upp i lungexplantat. För det andra kommer PA-specifika IgA-antikroppar att analyseras i bronkial lavage och sputumvätskor och korreleras till kolonisationsdata.
3. för att utvärdera bidraget av S-IgA-defekt till lungpatologi hos CFTR KO-möss: Det potentiella bidraget från S-IgA-brist till CF-lungsjukdom kommer att bedömas in vivo med CFTR KO-möss. Eftersom dessa KO-möss inte rekapitulerar den mänskliga CF-fenotypen, kommer vi att dra fördel av vår pilotobservation att upprepad LPS-exponering - vilket leder till en KOL-liknande fenotyp (Juanita et al, 2002) - resulterar i pIgR/SC-nedreglering (se " Erhållna resultat"). Vi kommer således att utvärdera om pIgR-brist inducerad vid kronisk LPS-exponering främjar utvecklingen av en lungpatologi med CF-funktioner hos CFTR KO-möss. Följaktligen kunde dubbla (CFTR, pIgR) KO-möss genereras för att direkt adressera bidraget av pIgR-brist till lungpatologi i samband med CFTR-mutation. Dessutom kommer en andra modell som efterliknar ihållande PA-infektion (Martin et al, 2011) att användas för att ta itu med effekterna av PA i CFTR- och/eller pIgR KO-möss. Beta-eNaC Tg-möss har en baslinje lungpatologi och kan också erhållas och infekteras av en modell av PA-infektion (microbeads, Pr Burgel). Avläsningarna kommer att omfatta histomorfologiska och biomolekylära analyser (inflammatoriska och cytokinsvar) och lungfunktionstester (FlexiVent).
4. att utforska mekanismer för pIgR-nedreglering i CF-epitel: Eftersom CFBE 41o-cellinje (uttrycker wt eller mutant F508del CFTR; Bruscia et al, 2002) inte uttrycker signifikanta nivåer av pIgR (se "Erhållna resultat"), primär human bronkial epitelial celler (HBEC) kommer att användas för att bedöma om pIgR-nedreglering upprätthålls i CF-epitel som odlats in vitro. Primära odlingar i luft-vätskegränssnitt (ALI) av HBEC kommer att utföras från CF-patienter, jämfört med kontroller (up-and-running protokoll i PI:s labb vid KOL; celler från EpithelixR kommer också att användas; såväl som nasal celler från CF (de Courcey et al, 2012)). ALI-kulturer tillåter utvärdering av cellulära funktioner i ett polariserat och rekonstituerat muco-ciliärt luftvägsepitel, antingen vilande eller stimulerat av LPS och/eller IL-1. Om pIgR-uttrycket också minskar i CF-epitelet in vitro, kan det relatera till antingen CFTR-gendefekten och/eller till epigenetiskt minne av in vivo-intryckningen av epitelet av den inflammatoriska mikromiljön. Vi kommer alltså att särskilja dessa möjligheter genom att använda CFTR-hämmare (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). En annan post-transkriptionell mekanism för pIgR-dysfunktion inkluderar dess felaktiga adressering till cellmembranet: förhållandet mellan stört uttryck av varje receptor (apikal CFTR, basal pIgR) kommer att utvärderas. Avläsningar kommer att inkludera pIgR-uttryck bedömt genom immunfärgning (av filter) och western blöt och med RT-qPCR. Funktionen av pIgR kommer att testas genom att mäta kapaciteten hos ALI-epitelet att transcytosera dimert IgA från basolateral till apikala avdelningen. Membranadressering av CFTR (apikal) och pIgR (basal) kommer att studeras med konfokalmikroskopi.