Deterioro de la IgA secretora y la inmunidad de la mucosa en la fibrosis quística (Forton2015)

Deterioro de la IgA secretora y la inmunidad de la mucosa en la fibrosis quística:

papel de los cambios epiteliales relacionados con CFTR en la regulación de la transcitosis de IgA mediada por pIgR y contribución a la patología pulmonar y deterioro de la defensa contra infecciones bacterianas.

DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO La fibrosis quística (FQ) representa el trastorno autosómico recesivo letal más común en la población blanca, afectando principalmente a los pulmones. Veinticuatro años después de la identificación del gen responsable de la enfermedad, quedan muchas preguntas, los tratamientos actuales son sintomáticos y sigue siendo una enfermedad letal. Afecta al gen Regulador Transmembrana de Fibrosis Quística (CFTR), que codifica una proteína expresada en la membrana apical de las células epiteliales de las vías respiratorias, donde actúa como un canal de cloro dependiente de cAMP y regulador de otros canales, incluido el canal epitelial de Na+ (ENaC) . Las mutaciones de CFTR (F508del, 70% de los casos) dan como resultado un mal funcionamiento o la ausencia total de la proteína CFTR en la membrana apical, debido al mal plegamiento de la proteína y la retención en el retículo endoplásmico. Da lugar a defectos en la salida de cloruro y la hidratación del líquido de revestimiento epitelial, lo que da lugar a una mucosidad anormalmente viscosa que puede obstruir las vías respiratorias, la luz intestinal y los conductos glandulares (p. ej., en el páncreas). La disfunción de CFTR también conduce a la activación proinflamatoria (p. ej., a través de NFkB) del epitelio, lo que da como resultado la liberación de CXCL8/IL8 (Sloane et al, 2005) y una producción alterada de factores protectores como las a-defensinas. La colonización de las vías respiratorias y las infecciones pulmonares son un sello distintivo de esta enfermedad, en particular con Pseudomonas aeruginosa (PA), que afecta al 70 % de los pacientes con FQ y se asocia con malos resultados clínicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la persistencia de patógenos en las vías respiratorias de la FQ siguen sin estar claros.

Este proyecto tiene como objetivo investigar si la producción de IgA secretora (S-IgA) está alterada en el pulmón con FQ, a través de qué mecanismos y si este defecto contribuye a la patogénesis de la FQ al afectar la inmunoprotección contra patógenos respiratorios como la PA. La S-IgA es una línea principal de defensa de la mucosa, a través de la llamada exclusión inmune de antígenos y patógenos inhalados/ingeridos (Norderhaug et al, 1999). Después de la síntesis de IgA polimérica (principalmente dimérica) por parte de las células plasmáticas de la mucosa subepitelial, la p-IgA se transporta a través del epitelio mediante una ruta transcelular mediada por el receptor de inmunoglobulina polimérica (pIgR). La P-IgA se une a la pIgR en el polo basolateral del epitelio y se transcita hasta el polo apical, donde una escisión proteolítica libera la parte extracelular de la pIgR, denominada componente secretor (CS), que permanece unida a la p-IgA para forma S-IgA. Este transporte representa la ruta transcelular más importante del organismo (3 g/día). La S-IgA se produce principalmente tras la estimulación de la mucosa por señales microbianas que actúan a través de los receptores tipo Toll en las células epiteliales y las células B (MacPherson et al, 2008), mientras que las citoquinas (IFN-g, IL-4, IL-1 o TNF-a) puede aumentar la expresión de pIgR y/o la transcitosis (ver revisión Pilette et al, 2001a).

Se ha identificado un defecto en la expresión de pIgR en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) inducida por el humo (Pilette et al, 2001b). La reducción de pIgR en la EPOC podría deberse a la degradación por serina proteinasas derivadas de neutrófilos (Pilette et al, 2003), así como a la transcripción de genes alterada (Gohy & Pilette, manuscrito presentado). A diferencia de la EPOC, no está claro si la expresión de pIgR se ve afectada en la FQ, a través de qué mecanismos y, de ser así, con qué consecuencias en términos de defensa de la mucosa. Nuestra hipótesis es que la expresión de pIgR se reduce en el epitelio de la FQ, como resultado de los cambios epiteliales relacionados con la CFTR, y conduce a una exclusión inmune deficiente de los patógenos respiratorios mediada por IgA, lo que favorece la colonización bacteriana crónica y las infecciones pulmonares en la FQ. Los objetivos específicos de este proyecto son los siguientes:

1. para evaluar la expresión de pIgR e IgA en tejido bronquial de pacientes con FQ, en comparación con los controles. Esto se realizará tanto en explantes de pulmón de pacientes con FQ con enfermedad pulmonar en etapa terminal (11 de KULeuven y 18 de París, ya recolectados; en comparación con 7 explantes de controles y muestras quirúrgicas de pulmón de no fumadores) como en biopsias bronquiales. (n=8) y LBA (2x50 ml) muestreados durante las broncoscopias previas al trasplante (muestreo prospectivo, KULeuven). Los sujetos de control serán pacientes sin FQ y sin evidencia de enfermedad pulmonar y que estén sufriendo narcosis por una razón independiente en el centro KULeuven. Además, también se analizará una serie de esputos (de pacientes con FQ y de control). Los sujetos control consistirán en pacientes con EPOC y sujetos sanos (fumadores o no). Además, también se obtendrán biopsias nasosinusales y rectales de la FQ para investigar los tejidos de la FQ de la mucosa fuera del entorno pulmonar. Las lecturas consistirán en la expresión de pIgR tanto a nivel de genes (RT-qPCR) como de proteínas (inmunohistoquímica, western blot), así como de IgA (inmunohistoquímica, RT-qPCR para IgA1 e IgA2). Además, se medirá (S-)IgA y SC en líquidos de lavado bronquial y en esputo.

   Globalmente, esperábamos si fuera posible analizar 30 explantes, 30 endoscopias y 150 esputos.

2. para evaluar los anticuerpos S-IgA contra las bacterias respiratorias en las vías respiratorias de la FQ: se evaluará la relevancia de la deficiencia de S-IgA en la FQ con respecto a la colonización microbiana de las vías respiratorias inferiores. En primer lugar, se evaluará la correlación entre los niveles bajos de S-IgA (tanto IgA total como IgA específica de patógenos) y la colonización por patógenos, en particular PA, en esputo y fluidos de lavado bronquial de pacientes con FQ. Además, en explantes de pulmón también se abordará una relación regional/espacial entre el defecto de S-IgA y la tinción de PA. En segundo lugar, los anticuerpos IgA específicos de PA se analizarán en lavado bronquial y fluidos de esputo, y se correlacionarán con los datos de colonización.
3. para evaluar la contribución del defecto S-IgA a la patología pulmonar en ratones CFTR KO: La contribución potencial de la deficiencia de S-IgA a la enfermedad pulmonar FQ se evaluará in vivo, usando ratones CFTR KO. Como estos ratones KO no recapitulan el fenotipo de FQ humano, aprovecharemos nuestra observación piloto de que la exposición repetida a LPS, que conduce a un fenotipo similar a la EPOC (Juanita et al, 2002), da como resultado una regulación a la baja de pIgR/SC (ver " Resultados obtenidos"). Por lo tanto, evaluaremos si la deficiencia de pIgR inducida por la exposición crónica a LPS promueve en ratones CFTR KO el desarrollo de una patología pulmonar con características de FQ. En consecuencia, se podrían generar ratones KO dobles (CFTR, pIgR) para abordar directamente la contribución de la deficiencia de pIgR a la patología pulmonar junto con la mutación de CFTR. Además, se utilizará un segundo modelo que imita la infección persistente por PA (Martin et al, 2011) para abordar los efectos de la PA en ratones CFTR y/o pIgR KO. Los ratones Beta-eNaC Tg tienen una patología pulmonar de referencia y también podrían obtenerse e infectarse mediante un modelo de infección por PA (microesferas, Pr Burgel). Las lecturas incluirán análisis histomorfológicos y biomoleculares (respuestas inflamatorias y de citocinas) y pruebas de función pulmonar (FlexiVent).
4. para explorar los mecanismos de regulación a la baja de pIgR en el epitelio de FQ: como la línea de células CFBE 41o (que expresa wt o mutante F508del CFTR; Bruscia et al, 2002) no expresa niveles significativos de pIgR (ver "Resultados obtenidos"), el epitelio bronquial humano primario (HBEC) se utilizarán para evaluar si la regulación negativa de pIgR se mantiene en el epitelio de FQ cultivado in vitro. Se realizarán cultivos primarios en interfaz aire-líquido (ALI) de HBEC de pacientes con FQ, en comparación con los controles (protocolo en funcionamiento en el laboratorio de IP en EPOC; también se utilizarán células de EpithelixR; así como nasal células de CF (de Courcey et al, 2012)). Los cultivos ALI permiten evaluar las funciones celulares en un epitelio mucociliar polarizado y reconstituido de las vías respiratorias, ya sea en reposo o estimulado por LPS y/o IL-1. Si la expresión de pIgR también disminuye en el epitelio de FQ in vitro, podría relacionarse con el defecto del gen CFTR y/o con la memoria epigenética de la impronta in vivo del epitelio por el microambiente inflamatorio. Por lo tanto, distinguiremos estas posibilidades mediante el uso de inhibidores de CFTR (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). Otro mecanismo postranscripcional de la disfunción de pIgR incluye su direccionamiento incorrecto a la membrana celular: se evaluará la relación entre la expresión alterada de cada receptor (CFTR apical, pIgR basal). Las lecturas incluirán la expresión de pIgR evaluada mediante inmunotinción (de filtros) y western blot, y mediante RT-qPCR. La función del pIgR se probará midiendo la capacidad del epitelio ALI para transcitosar IgA dimérica desde el compartimento basolateral al apical. El direccionamiento de membrana de CFTR (apical) y pIgR (basal) se estudiará mediante microscopía confocal.