IgA secretora prejudicada e imunidade da mucosa na fibrose cística (Forton2015)

IgA secretora prejudicada e imunidade da mucosa na fibrose cística:

papel das alterações epiteliais relacionadas ao CFTR na regulação da transcitose de IgA mediada por pIgR e contribuição para a patologia pulmonar e defesa prejudicada contra infecções bacterianas.

DESCRIÇÃO DO PROJETO A fibrose cística (FC) representa a doença autossômica recessiva letal mais comum na população branca, afetando principalmente os pulmões. Vinte e quatro anos após a identificação do gene responsável pela doença, muitas dúvidas permanecem, os tratamentos atuais são sintomáticos e continua sendo uma doença letal. Afeta o gene Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR), que codifica uma proteína expressa na membrana apical das células epiteliais das vias aéreas, onde atua como um canal de cloreto dependente de AMPc e regulador de outros canais, incluindo o canal epitelial de Na+ (ENaC). . As mutações do CFTR (F508del, 70% dos casos) resultam em mau funcionamento ou ausência completa da proteína CFTR na membrana apical, devido ao dobramento incorreto da proteína e retenção no retículo endoplasmático. Isso resulta em defeitos no efluxo de cloreto e na hidratação do fluido de revestimento epitelial, resultando em muco anormalmente viscoso que pode obstruir as vias aéreas, o lúmen intestinal e os ductos glandulares (por exemplo, no pâncreas). A disfunção do CFTR também leva à ativação pró-inflamatória (por exemplo, através do NFkB) do epitélio, resultando na liberação de CXCL8/IL8 (Sloane et al, 2005) e produção prejudicada de fatores protetores, como a-defensinas. A colonização das vias aéreas e as infecções pulmonares são uma marca registrada desta doença, em particular com Pseudomonas aeruginosa (PA) que afeta 70% dos pacientes com FC e está associada a resultados clínicos ruins. No entanto, os mecanismos subjacentes à persistência de patógenos nas vias aéreas da FC permanecem pouco claros.

Este projeto tem como objetivo investigar se a produção de IgA secretora (S-IgA) está prejudicada no pulmão da FC, por quais mecanismos, e se esse defeito contribui para a patogênese da FC ao prejudicar a imunoproteção contra patógenos respiratórios como a PA. A S-IgA é uma importante linha de defesa da mucosa, através da chamada exclusão imunológica de antígenos e patógenos inalados/ingeridos (Norderhaug et al, 1999). Após a síntese de IgA polimérica (principalmente dimérica) pelas células plasmáticas da mucosa subepitelial, a p-IgA é transportada através do epitélio por um roteamento transcelular mediado pelo receptor de imunoglobulina polimérica (pIgR). A P-IgA liga-se ao pIgR no pólo basolateral do epitélio, e é transcitada até o pólo apical, onde uma clivagem proteolítica libera a parte extracelular do pIgR, denominada componente secretor (SC) que permanece ligada ao p-IgA para forma S-IgA. Este transporte representa a rota transcelular mais importante no corpo (3g/dia). A S-IgA é produzida principalmente após estimulação da mucosa por sinais microbianos que atuam através de receptores semelhantes a Toll em células epiteliais e células B (MacPherson et al, 2008), enquanto as citocinas (IFN-g, IL-4, IL-1 ou TNF-a) pode regular positivamente a expressão de pIgR e/ou transcitose (ver revisão Pilette et al, 2001a).

Um defeito na expressão de pIgR foi identificado na doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) induzida por fumaça (Pilette et al, 2001b). A redução de pIgR na DPOC pode ser devida à degradação por serina proteinases derivadas de neutrófilos (Pilette et al, 2003), bem como à transcrição de genes prejudicada (Gohy & Pilette, manuscrito submetido). Ao contrário da DPOC, ainda não está claro se a expressão de pIgR é afetada na FC, por quais mecanismos e, em caso afirmativo, com quais consequências em termos de defesa da mucosa. Nossa hipótese é que a expressão de pIgR é reduzida no epitélio da FC, como resultado de alterações epiteliais relacionadas ao CFTR, e leva à exclusão imune mediada por IgA prejudicada de patógenos respiratórios, favorecendo assim a colonização bacteriana crônica e infecções pulmonares na FC. Os objetivos específicos deste projeto são os seguintes:

1. avaliar a expressão de pIgR & IgA no tecido brônquico de pacientes com FC, em comparação com controles. Isso será realizado tanto em explantes pulmonares de pacientes com FC com doença pulmonar em estágio terminal (11 de KULeuven e 18 de Paris, já coletados; em comparação com 7 explantes de controles e espécimes cirúrgicos pulmonares de não fumantes) quanto em biópsias brônquicas (n=8) e BAL (2x50mL) amostrados durante broncoscopias pré-transplante (amostragem prospectiva, KULeuven). Os sujeitos de controle serão pacientes sem FC e sem evidência de doença pulmonar e que estão passando por narcose por um motivo independente no centro KULeuven. Além disso, uma série de escarro (de pacientes com FC e controles) também será analisada. Os indivíduos de controle consistirão em pacientes com DPOC e indivíduos saudáveis ​​(fumantes ou não). Além disso, também serão obtidas biópsias nasossinusais e retais da FC, a fim de investigar os tecidos mucosos da FC fora do ambiente pulmonar. As leituras consistirão na expressão de pIgR nos níveis de gene (RT-qPCR) e proteína (imuno-histoquímica, western blot), bem como para IgA (imuno-histoquímica, RT-qPCR para IgA1 e IgA2). Além disso, (S-)IgA e SC serão medidos em fluidos de lavagem brônquica e no escarro.

   Globalmente, esperávamos, se possível, analisar 30 explantes, 30 endoscopias e 150 escarros.

2. para avaliar os anticorpos S-IgA para bactérias respiratórias nas vias aéreas da FC: A relevância da deficiência de S-IgA na FC será avaliada em relação à colonização microbiana das vias aéreas inferiores. Primeiro, a correlação entre baixos níveis de S-IgA (IgA total e IgA específica do patógeno) e colonização por patógenos - em particular PA - será testada em escarro e fluidos de lavagem brônquica de pacientes com FC. Além disso, em explantes pulmonares, também será abordada uma relação regional/espacial entre o defeito S-IgA e a coloração PA. Em segundo lugar, anticorpos IgA específicos para PA serão testados em lavado brônquico e fluidos de escarro e correlacionados com dados de colonização.
3. avaliar a contribuição do defeito de S-IgA para a patologia pulmonar em camundongos CFTR KO: A contribuição potencial da deficiência de S-IgA para a doença pulmonar de CF será avaliada in vivo, usando camundongos CFTR KO. Como esses camundongos KO não recapitulam o fenótipo humano da FC, aproveitaremos nossa observação piloto de que a exposição repetida ao LPS - que leva a um fenótipo semelhante à DPOC (Juanita et al, 2002) - resulta na regulação negativa de pIgR/SC (consulte " Resultados obtidos"). Assim, avaliaremos se a deficiência de pIgR induzida pela exposição crônica ao LPS promove em camundongos CFTR KO o desenvolvimento de uma patologia pulmonar com características de FC. Consequentemente, camundongos KO duplos (CFTR, pIgR) podem ser gerados para abordar diretamente a contribuição da deficiência de pIgR para a patologia pulmonar em conjunto com a mutação CFTR. Além disso, um segundo modelo que imita a infecção persistente por PA (Martin et al, 2011) será usado para abordar os efeitos do PA em camundongos CFTR e/ou pIgR KO. Camundongos Beta-eNaC Tg têm uma patologia pulmonar de linha de base e também podem ser obtidos e infectados por um modelo de infecção por PA (microbeads, Pr Burgel). As leituras incluirão análises histomorfológicas e biomoleculares (respostas inflamatórias e de citocinas) e testes de função pulmonar (FlexiVent).
4. para explorar os mecanismos de regulação negativa de pIgR no epitélio CF: Como a linhagem de células CFBE 41o (expressando wt ou mutante F508del CFTR; Bruscia et al, 2002) não expressa níveis significativos de pIgR (consulte "Resultados obtidos"), o epitélio brônquico humano primário células (HBEC) serão usadas para avaliar se a regulação negativa de pIgR é mantida no epitélio da FC cultivado in vitro. Culturas primárias em interface ar-líquido (ALI) de HBEC serão realizadas de pacientes com FC, em comparação com controles (protocolo em funcionamento no laboratório do PI em DPOC; também serão utilizadas células do EpithelixR; assim como células de FC (de Courcey et al, 2012)). As culturas de ALI permitem avaliar as funções celulares em um epitélio mucociliar das vias aéreas polarizado e reconstituído, em repouso ou estimulado por LPS e/ou IL-1. Se a expressão de pIgR também estiver diminuída no epitélio da FC in vitro, isso pode estar relacionado ao defeito do gene CFTR e/ou à memória epigenética do imprinting in vivo do epitélio pelo microambiente inflamatório. Iremos, assim, distinguir essas possibilidades usando inibidores de CFTR (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). Outro mecanismo pós-transcricional da disfunção do pIgR inclui seu endereçamento errado para a membrana celular: a relação entre a expressão perturbada de cada receptor (CFTR apical, pIgR basal) será avaliada. As leituras incluirão a expressão de pIgR avaliada por imunocoloração (de filtros) e western blot, e por RT-qPCR. A função do pIgR será testada medindo a capacidade do epitélio da ALI de transcitar IgA dimérica do compartimento basolateral para o apical. O endereçamento da membrana de CFTR (apical) e pIgR (basal) será estudado por microscopia confocal.