Alterata IgA secretoria e immunità mucosa nella fibrosi cistica (Forton2015)

Alterazione delle IgA secretorie e dell'immunità della mucosa nella fibrosi cistica:

ruolo dei cambiamenti epiteliali correlati a CFTR nella regolazione della transcitosi IgA mediata da pIgR e contributo alla patologia polmonare e alla difesa compromessa contro le infezioni batteriche.

DESCRIZIONE DEL PROGETTO La fibrosi cistica (CF) rappresenta la malattia autosomica recessiva letale più comune nella popolazione bianca, che colpisce principalmente i polmoni. Ventiquattro anni dopo l'identificazione del gene responsabile della malattia, rimangono molti interrogativi, le cure attuali sono sintomatiche e rimane una malattia letale. Colpisce il gene Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR), che codifica per una proteina espressa sulla membrana apicale delle cellule epiteliali delle vie aeree, dove agisce come canale del cloruro cAMP-dipendente e regolatore di altri canali, incluso il canale epiteliale del Na+ (ENaC) . Le mutazioni del CFTR (F508del, 70% dei casi) provocano un malfunzionamento o la completa assenza della proteina CFTR sulla membrana apicale, a causa del misfolding proteico e della ritenzione nel reticolo endoplasmatico. Provoca difetti nell'efflusso di cloruro e nell'idratazione del fluido di rivestimento epiteliale, con conseguente muco anormalmente viscoso che può ostruire le vie aeree, il lume intestinale e i dotti ghiandolari (ad esempio nel pancreas). La disfunzione del CFTR porta anche all'attivazione pro-infiammatoria (ad esempio attraverso NFkB) dell'epitelio, con conseguente rilascio di CXCL8/IL8 (Sloane et al, 2005) e ridotta produzione di fattori protettivi come le a-defensine. La colonizzazione delle vie aeree e le infezioni polmonari sono un segno distintivo di questa malattia, in particolare con Pseudomonas aeruginosa (PA) che colpisce il 70% dei pazienti CF ed è associata a scarsi risultati clinici. Tuttavia, i meccanismi alla base della persistenza dei patogeni nelle vie aeree CF rimangono in gran parte poco chiari.

Questo progetto mira a indagare se la produzione di IgA secretorie (S-IgA) è compromessa nel polmone FC, attraverso quali meccanismi, e se questo difetto contribuisce alla patogenesi della FC compromettendo l'immunoprotezione contro i patogeni respiratori come la PA. L'S-IgA è un'importante linea di difesa della mucosa, attraverso la cosiddetta esclusione immunitaria di antigeni e agenti patogeni inalati/ingeriti (Norderhaug et al, 1999). Dopo la sintesi di IgA polimeriche (principalmente dimeriche) da parte delle plasmacellule della mucosa subepiteliale, le p-IgA vengono trasportate attraverso l'epitelio mediante un percorso transcellulare mediato dal recettore delle immunoglobuline polimeriche (pIgR). La P-IgA si lega alla pIgR al polo basolaterale dell'epitelio, ed è transcitosizzata fino al polo apicale, dove una scissione proteolitica libera la parte extracellulare della pIgR, chiamata componente secretoria (SC) che rimane legata alla p-IgA per forma S-IgA. Questo trasporto rappresenta il percorso transcellulare più importante nel corpo (3 g/giorno). La S-IgA è prodotta principalmente su stimolazione della mucosa da segnali microbici che agiscono attraverso i recettori Toll-like sulle cellule epiteliali e sulle cellule B (MacPherson et al, 2008) mentre le citochine (IFN-g, IL-4, IL-1 o TNF-a) può sovraregolare l'espressione di pIgR e/o la transcitosi (vedi recensione Pilette et al, 2001a).

Un difetto dell'espressione di pIgR è stato identificato nella broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) indotta dal fumo (Pilette et al, 2001b). La riduzione del pIgR nella BPCO potrebbe essere dovuta alla degradazione da parte delle serina proteinasi derivate dai neutrofili (Pilette et al, 2003), nonché alla compromissione della trascrizione genica (Gohy & Pilette, manoscritto presentato). A differenza della BPCO, non è chiaro se l'espressione di pIgR sia influenzata nella FC, attraverso quali meccanismi e, in caso affermativo, con quali conseguenze in termini di difesa della mucosa. La nostra ipotesi è che l'espressione di pIgR sia ridotta negli epiteli CF, come risultato dei cambiamenti epiteliali correlati a CFTR, e porti a un'alterata esclusione immunitaria mediata da IgA dei patogeni respiratori, favorendo così la colonizzazione batterica cronica e le infezioni polmonari nella FC. Gli obiettivi specifici di questo progetto sono i seguenti:

1. per valutare l'espressione di pIgR e IgA nel tessuto bronchiale di pazienti CF, rispetto ai controlli. Ciò verrà eseguito sia in espianti polmonari da pazienti CF con malattia polmonare allo stadio terminale (11 da KULeuven e 18 da Parigi, già raccolti; rispetto a 7 espianti da controlli e a campioni chirurgici polmonari da non fumatori) e in biopsie bronchiali (n=8) e BAL (2x50mL) campionati durante le broncoscopie pre-trapianto (campionamento prospettico, KULeuven). I soggetti di controllo saranno pazienti senza FC e senza evidenza di malattia polmonare e che sono sottoposti a narcosi per un motivo indipendente presso il centro KULeuven. Inoltre, verrà analizzata anche una serie di espettorato (da pazienti FC e di controllo). I soggetti di controllo saranno costituiti da pazienti con BPCO e soggetti sani (fumatori e non). Saranno inoltre ottenute biopsie nasosinusali e rettali da FC, al fine di indagare i tessuti fibrosi della mucosa al di fuori dell'ambiente polmonare. Le letture consisteranno nell'espressione di pIgR sia a livello genico (RT-qPCR) che proteico (immunoistochimica, western blot), così come per IgA (immunoistochimica, RT-qPCR per IgA1 e IgA2). Inoltre, (S-)IgA e SC saranno misurate nei fluidi di lavaggio bronchiale e nell'espettorato.

   A livello globale, ci aspettavamo, se possibile, di analizzare 30 espianti, 30 endoscopie e 150 espettorati.

2. per valutare gli anticorpi S-IgA contro i batteri respiratori nelle vie aeree CF: La rilevanza del deficit di S-IgA nella FC sarà valutata in relazione alla colonizzazione microbica delle vie aeree inferiori. In primo luogo, verrà testata la correlazione tra bassi livelli di S-IgA (sia IgA totali che IgA specifiche per patogeno) e colonizzazione da parte di patogeni - in particolare PA - nell'espettorato e nei fluidi di lavaggio bronchiale di pazienti CF. Inoltre, negli espianti polmonari verrà affrontata anche una relazione regionale/spaziale tra difetto S-IgA e colorazione PA. In secondo luogo, gli anticorpi IgA PA-specifici saranno dosati nel lavaggio bronchiale e nei fluidi dell'espettorato e correlati ai dati di colonizzazione.
3. per valutare il contributo del difetto di S-IgA alla patologia polmonare nei topi CFTR KO: Il potenziale contributo del deficit di S-IgA alla malattia polmonare CF sarà valutato in vivo, utilizzando topi CFTR KO. Poiché questi topi KO non ricapitolano il fenotipo CF umano, approfitteremo della nostra osservazione pilota che l'esposizione ripetuta a LPS - che porta a un fenotipo simile alla BPCO (Juanita et al, 2002) - si traduce in una downregulation di pIgR/SC (vedi " Risultati ottenuti"). Valuteremo quindi se il deficit di pIgR indotto dall'esposizione cronica a LPS promuova nei topi CFTR KO lo sviluppo di una patologia polmonare con caratteristiche CF. Di conseguenza, i topi KO doppi (CFTR, pIgR) potrebbero essere generati per affrontare direttamente il contributo del deficit di pIgR alla patologia polmonare in combinazione con la mutazione CFTR. Inoltre, verrà utilizzato un secondo modello che imita l'infezione persistente da PA (Martin et al, 2011) per affrontare gli effetti della PA nei topi CFTR e/o pIgR KO. I topi Beta-eNaC Tg hanno una patologia polmonare di base e potrebbero anche essere ottenuti e infettati da un modello di infezione PA (microbeads, Pr Burgel). Le letture includeranno analisi istomorfologiche e biomolecolari (risposte infiammatorie e citochiniche) e test di funzionalità polmonare (FlexiVent).
4. per esplorare i meccanismi di downregulation di pIgR nell'epitelio CF: poiché la linea cellulare CFBE 41o (che esprime wt o mutante F508del CFTR; Bruscia et al, 2002) non esprime livelli significativi di pIgR (vedi "Risultati ottenuti"), l'epitelio bronchiale umano primario cellule (HBEC) saranno utilizzate per valutare se la downregulation di pIgR è mantenuta nell'epitelio CF coltivato in vitro. Colture primarie in interfaccia aria-liquido (ALI) di HBEC saranno effettuate da pazienti CF, rispetto ai controlli (protocollo attivo nel laboratorio del PI nella BPCO; saranno utilizzate anche cellule di EpithelixR; così come colture nasali cellule da CF (de Courcey et al, 2012)). Le colture ALI consentono di valutare le funzioni cellulari in un epitelio delle vie aeree muco-ciliari polarizzato e ricostituito, a riposo o stimolato da LPS e/o IL-1. Se l'espressione di pIgR è diminuita anche nell'epitelio CF in vitro, potrebbe essere correlata al difetto del gene CFTR e/o alla memoria epigenetica dell'imprinting in vivo dell'epitelio da parte del microambiente infiammatorio. Distingueremo quindi queste possibilità utilizzando inibitori CFTR (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). Un altro meccanismo post-trascrizionale della disfunzione di pIgR include il suo errato indirizzamento alla membrana cellulare: verrà valutata la relazione tra l'espressione disturbata di ciascun recettore (CFTR apicale, pIgR basale). Le letture includeranno l'espressione di pIgR valutata mediante immunocolorazione (di filtri) e western blot, e mediante RT-qPCR. La funzione del pIgR sarà testata misurando la capacità dell'epitelio ALI di transcitosi IgA dimerica dal compartimento basolaterale a quello apicale. L'indirizzamento di membrana di CFTR (apicale) e pIgR (basale) sarà studiato mediante microscopia confocale.