囊性纤维化中分泌性 IgA 和粘膜免疫受损 (Forton2015)

囊性纤维化中分泌性 IgA 和粘膜免疫受损：

CFTR 相关的上皮细胞变化在调节 pIgR 介导的 IgA 转胞吞作用中的作用以及对肺病理学和细菌感染防御受损的贡献。

项目描述 囊性纤维化 (CF) 是白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病，主要影响肺部。 在确定导致该疾病的基因 24 年后，许多问题仍然存在，目前的治疗是对症的，它仍然是一种致命的疾病。 它影响囊性纤维化跨膜调节因子 (CFTR) 基因，该基因编码一种在气道上皮细胞顶膜上表达的蛋白质，在此处它充当 cAMP 依赖性氯离子通道和其他通道的调节因子，包括上皮 Na+ 通道 (ENaC) . CFTR 突变（F508del，70% 的病例）由于蛋白质错误折叠和滞留在内质网中，导致顶端膜上的 CFTR 蛋白发生故障或完全缺失。 它导致氯化物流出和上皮衬里液水合缺陷，导致异常粘稠的粘液可能阻塞气道、肠腔和腺管（例如胰腺）。 CFTR 功能障碍还会导致上皮细胞的促炎性激活（例如通过 NFkB），从而导致 CXCL8/IL8 释放（Sloane 等人，2005 年）和保护因子（例如 α-防御素）的产生受损。 气道的气道定植和肺部感染是这种疾病的标志，尤其是铜绿假单胞菌 (PA)，它影响 70% 的 CF 患者并且与不良临床结果相关。 然而，病原体在 CF 气道中持续存在的机制在很大程度上仍不清楚。

该项目旨在研究 CF 肺中分泌型 IgA (S-IgA) 的产生是否受损、通过何种机制受损，以及该缺陷是否通过削弱对呼吸道病原体（如 PA）的免疫保护作用而导致 CF 的发病机制。 S-IgA 是粘膜防御的主要防线，通过吸入/摄入的抗原和病原体的所谓免疫排除（Norderhaug 等人，1999）。 在上皮下粘膜浆细胞合成多聚体（主要是二聚体）IgA 后，p-IgA 通过多聚免疫球蛋白受体 (pIgR) 介导的跨细胞途径转运穿过上皮细胞。 P-IgA 在上皮基底外侧极与 pIgR 结合，并被转胞吞作用至顶端极，在那里蛋白水解裂解释放 pIgR 的细胞外部分，称为分泌成分 (SC)，它仍然与 p-IgA 结合以形成 S-IgA。 这种运输代表了体内最重要的跨细胞路径（3g/天）。 S-IgA 主要是在通过上皮细胞和 B 细胞上的 Toll 样受体作用的微生物信号刺激粘膜时产生的（MacPherson 等人，2008 年），而细胞因子（IFN-g、IL-4、IL-1 或 TNF-a）可能会上调 pIgR 表达和/或转胞吞作用（参见评论 Pilette 等人，2001a）。

已在烟雾诱发的慢性阻塞性肺病 (COPD) 中鉴定出 pIgR 表达缺陷（Pilette 等，2001b）。 COPD 中 pIgR 的减少可能是由于中性粒细胞衍生的丝氨酸蛋白酶的降解（Pilette 等人，2003 年）以及基因转录受损（Go​​hy 和 Pilette，提交的手稿）。 与 COPD 相比，目前尚不清楚 pIgR 表达是否在 CF 中受到影响，通过何种机制，如果受到影响，在粘膜防御方面会产生何种后果。 我们的假设是，由于 CFTR 相关的上皮细胞变化，CF 上皮细胞中的 pIgR 表达减少，并导致 IgA 介导的呼吸道病原体免疫排斥受损，从而有利于 CF 中的慢性细菌定植和肺部感染。 本项目的具体目标如下：

1. 与对照相比，评估 CF 患者支气管组织中的 pIgR 和 IgA 表达。 这将在患有终末期肺病的 CF 患者的肺外植体（11 个来自 KULeuven 和 18 个来自巴黎，已经收集；与 7 个来自对照的外植体和来自非吸烟者的肺手术标本相比）和支气管活检中进行(n=8) 和 BAL (2x50mL) 在移植前支气管镜检查期间取样（前瞻性取样，KULeuven）。 对照受试者将是没有 CF 和没有肺病证据并且在 KULeuven 中心因独立原因接受麻醉的患者。 此外，还将分析一系列痰液（来自 CF 和对照患者）。 对照受试者将包括 COPD 患者和健康受试者（吸烟者或不吸烟者）。 此外，还将获得 CF 的鼻窦和直肠活检，以研究肺部环境之外的粘膜 CF 组织。 读数将包括基因 (RT-qPCR) 和蛋白质（免疫组织化学、蛋白质印迹）水平的 pIgR 表达，以及 IgA（免疫组织化学、IgA1 和 IgA2 的 RT-qPCR）。 此外，还将在支气管灌洗液和痰液中测量 (S-)IgA 和 SC。

   在全球范围内，我们希望尽可能分析 30 个外植体、30 个内窥镜检查和 150 个痰液。

2. 评估 CF 气道中针对呼吸道细菌的 S-IgA 抗体：将评估 CF 中 S-IgA 缺乏与下呼吸道微生物定植的相关性。 首先，将在 CF 患者的痰和支气管灌洗液中测试低 S-IgA 水平（总 IgA 和病原体特异性 IgA）与病原体定植（尤其是 PA）之间的相关性。 此外，在肺外植体中，S-IgA 缺陷与 PA 染色之间的区域/空间关系也将得到解决。 其次，将在支气管灌洗液和痰液中检测 PA 特异性 IgA 抗体，并将其与定植数据相关联。
3. 评估 S-IgA 缺陷对 CFTR KO 小鼠肺病理学的贡献：将使用 CFTR KO 小鼠在体内评估 S-IgA 缺陷对 CF 肺病的潜在贡献。 由于这些 KO 小鼠不会重现人类 CF 表型，我们将利用我们的试点观察结果，即重复 LPS 暴露——导致 COPD 样表型（Juanita 等人，2002 年）——导致 pIgR/SC 下调（参见“获得的结果”）。 因此，我们将评估慢性 LPS 暴露引起的 pIgR 缺陷是否会促进 CFTR KO 小鼠出现具有 CF 特征的肺病理学。 因此，可以生成双（CFTR，pIgR）KO 小鼠，以直接解决 pIgR 缺陷对肺病理学的贡献以及 CFTR 突变。 此外，第二个模型模拟持续性 PA 感染（Martin 等人，2011）将用于解决 CFTR 和/或 pIgR KO 小鼠中 PA 的影响。 Beta-eNaC Tg 小鼠具有基线肺病理学，也可以通过 PA 感染模型（微珠，Pr Burgel）获得和感染。 读数将包括组织形态学和生物分子分析（炎症和细胞因子反应）以及肺功能测试 (FlexiVent)。
4. 探索 CF 上皮中 pIgR 下调的机制：由于 CFBE 41o 细胞系（表达 wt 或突变体 F508del CFTR；Bruscia 等人，2002）不表达显着水平的 pIgR（参见“获得的结果”），原代人支气管上皮细胞细胞 (HBEC) 将用于评估 pIgR 下调是否维持在体外培养的 CF 上皮细胞中。 与对照相比，HBEC 气液界面 (ALI) 的原代培养将从 CF 患者中进行（PI 实验室在 COPD 中的启动和运行方案；还将使用来自 EpithelixR 的细胞；以及鼻来自 CF 的细胞（de Courcey 等人，2012 年））。 ALI 培养物允许评估极化和重建的粘膜纤毛气道上皮中的细胞功能，无论是静止的还是受 LPS 和/或 IL-1 刺激的。 如果体外 CF 上皮细胞中的 pIgR 表达也降低，则它可能与 CFTR 基因缺陷和/或炎症微环境对上皮细胞体内印记的表观遗传记忆有关。 因此，我们将通过使用 CFTR 抑制剂（CFTR-inh172、PPQ-102；Martin 等人，2013）来区分这些可能性。 pIgR 功能障碍的另一个转录后机制包括其对细胞膜的错误寻址：将评估每个受体（顶端 CFTR、基底 pIgR）的表达紊乱之间的关系。 读数将包括通过免疫染色（过滤器）和蛋白质印迹以及 RT-qPCR 评估的 pIgR 表达。 pIgR 的功能将通过测量 ALI 上皮细胞从基底外侧转胞吞二聚体 IgA 到顶端隔室的能力来测试。 CFTR（顶端）和 pIgR（基底）的膜寻址将通过共聚焦显微镜进行研究。