Nedsat sekretorisk IgA og slimhindeimmunitet ved cystisk fibrose (Forton2015)

Nedsat sekretorisk IgA og slimhindeimmunitet ved cystisk fibrose:

rolle af CFTR-relaterede epitelændringer i reguleringen af ​​pIgR-medieret IgA-transcytose og bidrag til lungepatologi og svækket forsvar mod bakterielle infektioner.

PROJEKTBESKRIVELSE Cystisk fibrose (CF) repræsenterer den mest almindelige letale autosomal recessive lidelse i den hvide befolkning, som hovedsageligt påvirker lungerne. Fireogtyve år efter identifikation af genet, der er ansvarligt for sygdommen, er der mange spørgsmål tilbage, nuværende behandlinger er symptomatiske, og det er fortsat en dødelig sygdom. Det påvirker Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator-genet (CFTR), som koder for et protein udtrykt på den apikale membran af luftvejsepitelceller, hvor det fungerer som en cAMP-afhængig kloridkanal og regulator af andre kanaler, herunder den epiteliale Na+-kanal (ENaC) . Mutationer af CFTR (F508del, 70% af tilfældene) resulterer enten i funktionsfejl eller fuldstændig fravær af CFTR-proteinet ved den apikale membran på grund af proteinfejlfoldning og retention i det endoplasmatiske retikulum. Det resulterer i defekter i kloridudstrømning og hydrering af epitelforingsvæsken, hvilket resulterer i unormalt tyktflydende slim, som kan blokere luftvejene, tarmens lumen og kirtelkanalerne (f.eks. i bugspytkirtlen). CFTR-dysfunktion fører også til pro-inflammatorisk aktivering (f.eks. gennem NFkB) af epitelet, hvilket resulterer i CXCL8/IL8-frigivelse (Sloane et al, 2005) og nedsat produktion af beskyttende faktorer såsom a-defensiner. Luftvejskolonisering af luftvejene og lungeinfektioner er et kendetegn for denne sygdom, især med Pseudomonas aeruginosa (PA), der påvirker 70 % af CF-patienter og er forbundet med dårlige kliniske resultater. Imidlertid forbliver de mekanismer, der ligger til grund for persistensen af ​​patogener i CF-luftveje, stort set uklare.

Dette projekt har til formål at undersøge, om produktionen af ​​sekretorisk IgA (S-IgA) er svækket i CF-lungen, gennem hvilke mekanismer, og om denne defekt bidrager til patogenesen af ​​CF ved at forringe immunbeskyttelsen mod respiratoriske patogener som PA. S-IgA er en hovedlinje i slimhindeforsvaret gennem såkaldt immunudelukkelse af inhalerede/indtagede antigener og patogener (Norderhaug et al, 1999). Efter syntese af polymert (hovedsageligt dimert) IgA af subepitheliale slimhindeplasmaceller, transporteres p-IgA gennem epitelet ved en transcellulær routing medieret af den polymere immunoglobulinreceptor (pIgR). P-IgA binder til pIgR ved den basolaterale pol af epitelet og transcytoseres op til den apikale pol, hvor en proteolytisk spaltning frigiver den ekstracellulære del af pIgR, kaldet sekretorisk komponent (SC), som forbliver bundet til p-IgA til form S-IgA. Denne transport repræsenterer den vigtigste transcellulære routing i kroppen (3g/dag). S-IgA produceres hovedsageligt ved slimhindestimulering af mikrobielle signaler, der virker gennem Toll-lignende receptorer på epitelceller og B-celler (MacPherson et al, 2008), mens cytokiner (IFN-g, IL-4, IL-1 eller TNF-a) kan opregulere pIgR-ekspression og/eller transcytose (se gennemgang Pilette et al, 2001a).

En defekt i pIgR-ekspression er blevet identificeret i røginduceret kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) (Pilette et al, 2001b). Reduceret pIgR i KOL kan skyldes nedbrydning af neutrofil-afledte serinproteinaser (Pilette et al, 2003) såvel som svækket gentranskription (Gohy & Pilette, indsendt manuskript). I modsætning til KOL er det fortsat uklart, om pIgR-ekspression påvirkes i CF, gennem hvilke mekanismer, og i givet fald med hvilke konsekvenser i form af slimhindeforsvar. Vores hypotese er, at pIgR-ekspression er reduceret i CF-epitel, som et resultat af CFTR-relaterede epitelændringer, og fører til svækket IgA-medieret immunudelukkelse af respiratoriske patogener, hvilket favoriserer kronisk bakteriel kolonisering og lungeinfektioner i CF. De specifikke mål for dette projekt er som følger:

1. til at evaluere pIgR & IgA-ekspression i bronkialvæv fra CF-patienter sammenlignet med kontroller. Dette vil blive udført både i lungeeksplantater fra CF-patienter med lungesygdom i slutstadiet (11 fra KULeuven og 18 fra Paris, allerede indsamlet; sammenlignet med 7 eksplantater fra kontroller og til lungekirurgiske prøver fra ikke-rygere) og i bronkiale biopsier (n=8) og BAL (2x50mL) udtaget under pre-transplantation bronkoskopier (prospektiv prøvetagning, KULeuven). Kontrolpersoner vil være patienter uden CF og uden tegn på lungesygdom, og som er i narkose af en selvstændig årsag på KULeuven-centret. Derudover vil en række sputum (fra CF og kontrolpatienter) også blive analyseret. Kontrolpersoner vil bestå af KOL-patienter og raske forsøgspersoner (rygere eller ej). Desuden vil der også blive opnået nasosinusale og rektale biopsier fra CF for at undersøge slimhinde-CF-væv uden for lungemiljøet. Aflæsninger vil bestå af pIgR-ekspression på både gen- (RT-qPCR) og protein- (immunhistokemi, western blot) niveauer, såvel som for IgA (immunhistokemi, RT-qPCR for IgA1 og IgA2). Derudover vil (S-)IgA og SC blive målt i bronchial lavagevæsker og i sputum.

   Globalt forventede vi om muligt at analysere 30 eksplantater, 30 endoskopier og 150 sputum.

2. at vurdere S-IgA-antistoffer mod respiratoriske bakterier i CF-luftveje: Relevansen af ​​S-IgA-mangel ved CF vil blive vurderet med hensyn til mikrobiel kolonisering af nedre luftveje. Først vil korrelation mellem lave S-IgA-niveauer (både total IgA og patogenspecifik IgA) og kolonisering af patogener - især PA - blive testet i sputum og bronkial lavagevæsker fra CF-patienter. Derudover vil et regionalt/rumligt forhold mellem S-IgA-defekt og PA-farvning også blive behandlet i lungeeksplantater. For det andet vil PA-specifikke IgA-antistoffer blive analyseret i bronchial lavage og sputumvæsker og korreleret til koloniseringsdata.
3. for at evaluere bidraget af S-IgA-defekt til lungepatologi i CFTR KO-mus: Det potentielle bidrag fra S-IgA-mangel til CF-lungesygdom vil blive vurderet in vivo ved hjælp af CFTR KO-mus. Da disse KO-mus ikke rekapitulerer den humane CF-fænotype, vil vi drage fordel af vores pilotobservation, at gentagen LPS-eksponering - hvilket fører til en KOL-lignende fænotype (Juanita et al, 2002) - resulterer i pIgR/SC-nedregulering (se " Opnåede resultater"). Vi vil således evaluere, om pIgR-mangel induceret ved kronisk LPS-eksponering fremmer udviklingen af ​​en lungepatologi med CF-træk hos CFTR KO-mus. Følgelig kunne dobbelte (CFTR, pIgR) KO-mus genereres for direkte at adressere bidraget fra pIgR-mangel til lungepatologi i forbindelse med CFTR-mutation. Derudover vil en anden model, der efterligner vedvarende PA-infektion (Martin et al, 2011) blive brugt til at adressere virkningerne af PA i CFTR- og/eller pIgR KO-mus. Beta-eNaC Tg-mus har en baseline-lungepatologi og kan også opnås og inficeres med en model af PA-infektion (mikrokugler, Pr Burgel). Aflæsninger vil omfatte histomorfologiske og biomolekylære analyser (inflammatoriske og cytokinresponser) og lungefunktionstests (FlexiVent).
4. at udforske mekanismer for pIgR-nedregulering i CF-epitelet: Da CFBE 41o-cellelinje (udtrykker wt eller mutant F508del CFTR; Bruscia et al, 2002) ikke udtrykker signifikante niveauer af pIgR (se "Opnåede resultater"), er primært humant bronchial epitel. celler (HBEC) vil blive brugt til at vurdere, om pIgR-nedregulering opretholdes i CF-epitel dyrket in vitro. Primære kulturer i luft-væske interface (ALI) af HBEC vil blive udført fra CF-patienter sammenlignet med kontroller (up-and-running protokol i PI's laboratorium i KOL; celler fra EpithelixR vil også blive brugt; såvel som nasal celler fra CF (de Courcey et al, 2012)). ALI-kulturer gør det muligt at evaluere cellulære funktioner i et polariseret og rekonstitueret muco-ciliært luftvejsepitel, enten hvilende eller stimuleret af LPS og/eller IL-1. Hvis pIgR-ekspression også er nedsat i CF-epitelet in vitro, kan det relateres til enten CFTR-gendefekten og/eller til epigenetisk hukommelse af in vivo-prægningen af ​​epitelet af det inflammatoriske mikromiljø. Vi vil således skelne mellem disse muligheder ved at bruge CFTR-hæmmere (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). En anden post-transkriptionel mekanisme for pIgR-dysfunktion omfatter dens forkerte adressering til cellemembranen: forholdet mellem forstyrret ekspression af hver receptor (apikal CFTR, basal pIgR) vil blive evalueret. Aflæsninger vil omfatte pIgR-ekspression vurderet ved immunfarvning (af filtre) og western blot og ved RT-qPCR. Funktionen af ​​pIgR vil blive testet ved at måle kapaciteten af ​​ALI epitelet til at transcytose dimerisk IgA fra det basolaterale til det apikale kompartment. Membranadressering af CFTR (apikal) og pIgR (basal) vil blive undersøgt ved konfokal mikroskopi.