Károsodott szekréciós IgA és nyálkahártya immunitás cisztás fibrózisban (Forton2015)

Károsodott szekréciós IgA és nyálkahártya immunitás cisztás fibrózisban:

A CFTR-rel összefüggő epiteliális változások szerepe a pIgR által közvetített IgA transzcitózis szabályozásában, valamint hozzájárulás a tüdő patológiájához és a bakteriális fertőzések elleni védekezéshez.

A PROJEKT LEÍRÁSA A cisztás fibrózis (CF) a leggyakoribb halálos autoszomális recesszív rendellenesség a fehér populációban, amely főként a tüdőt érinti. Huszonnégy évvel a betegségért felelős gén azonosítása után sok kérdés maradt, a jelenlegi kezelések tüneti jellegűek, és továbbra is halálos betegség. Befolyásolja a cisztás fibrózis transzmembrán szabályozó (CFTR) gént, amely a légúti hámsejtek apikális membránján expresszálódó fehérjét kódol, ahol cAMP-függő kloridcsatornaként és más csatornák, köztük az epiteliális Na+ csatorna (ENaC) szabályozójaként működik. . A CFTR mutációi (F508del, az esetek 70%-a) vagy a CFTR fehérje hibás működését vagy teljes hiányát eredményezik az apikális membránon, a fehérje hibás feltekeredése és az endoplazmatikus retikulumban való visszatartása miatt. A hámburkoló folyadék klorid-kiáramlásának és hidratációjának meghibásodását eredményezi, ami abnormálisan viszkózus nyálkát eredményez, amely elzárhatja a légutakat, a bél lumenét és a mirigycsatornákat (például a hasnyálmirigyben). A CFTR diszfunkció a hám gyulladásos aktiválódásához is vezet (például az NFkB-n keresztül), ami CXCL8/IL8 felszabadulását eredményezi (Sloane és mtsai, 2005), és csökkenti a védőfaktorok, például az a-defenzinek termelését. A légutak légúti kolonizációja és a tüdőfertőzések ennek a betegségnek a jellemzői, különösen a Pseudomonas aeruginosa (PA) esetében, amely a CF-betegek 70%-át érinti, és rossz klinikai eredménnyel jár. A kórokozók CF légutakban való fennmaradásának hátterében álló mechanizmusok azonban nagyrészt tisztázatlanok.

A projekt célja annak vizsgálata, hogy a szekréciós IgA (S-IgA) termelése károsodott-e a CF-tüdőben, milyen mechanizmusokon keresztül, és hogy ez a hiba hozzájárul-e a CF patogeneziséhez azáltal, hogy rontja a légúti kórokozókkal, például a PA-val szembeni immunvédelmet. Az S-IgA a nyálkahártya védekezésének egyik fő vonala a belélegzett/lenyelt antigének és kórokozók úgynevezett immun-kizárása révén (Norderhaug és mtsai, 1999). A szubepithel nyálkahártya plazmasejtek által polimer (főként dimer) IgA szintézisét követően a p-IgA a polimer immunglobulin receptor (pIgR) által közvetített transzcelluláris úton transzportálódik az epitéliumon. A P-IgA a hám bazolaterális pólusán kötődik a pIgR-hez, és az apikális pólusig transzcitózódik, ahol a proteolitikus hasítás felszabadítja a pIgR extracelluláris részét, az úgynevezett szekréciós komponenst (SC), amely a p-IgA-hoz kötve marad. S-IgA-t alkotnak. Ez a transzport jelenti a legfontosabb transzcelluláris útvonalat a szervezetben (3 g/nap). Az S-IgA főként nyálkahártya-stimuláció hatására termelődik mikrobiális jelek hatására, amelyek Toll-szerű receptorokon keresztül hatnak a hámsejteken és a B-sejteken (MacPherson és mtsai, 2008), míg a citokinek (IFN-g, IL-4, IL-1 vagy TNF-a) fokozhatja a pIgR expresszióját és/vagy a transzcitózist (lásd Pilette és munkatársai, 2001a).

A pIgR expresszió hibáját azonosították a füst által kiváltott krónikus obstruktív tüdőbetegségben (COPD) (Pilette és mtsai, 2001b). A COPD-ben a csökkent pIgR oka lehet a neutrofil eredetű szerin proteinázok általi lebomlás (Pilette és mtsai, 2003), valamint a károsodott géntranszkripció (Gohy és Pilette, beküldött kézirat). A COPD-vel ellentétben továbbra sem világos, hogy a pIgR expressziója befolyásolja-e a CF-et, milyen mechanizmusokon keresztül, és ha igen, milyen következményekkel jár a nyálkahártya-védelem szempontjából. Hipotézisünk az, hogy a pIgR expressziója csökken a CF epitéliumban a CFTR-hez kapcsolódó hámváltozások eredményeként, és a légúti kórokozók IgA által közvetített immunkizárásának károsodásához vezet, ezáltal kedvez a krónikus bakteriális kolonizációnak és a tüdőfertőzéseknek CF-ben. A projekt konkrét céljai a következők:

1. a pIgR és IgA expresszió értékelésére CF-es betegek hörgőszövetében a kontrollokhoz képest. Ezt mind végstádiumú tüdőbetegségben szenvedő CF-betegek tüdőexplantátumain (11 KULeuvenből és 18 Párizsból származó, már begyűjtött; összehasonlítva a kontrollcsoportból származó 7 explantátummal és a nemdohányzók tüdősebészeti mintáival), valamint hörgőbiopsziákban. (n=8) és BAL (2x50mL) mintát vettek a transzplantáció előtti bronchoszkópiák során (prospektív mintavétel, KULeuven). A kontroll alanyok olyan betegek lesznek, akik nem szenvednek CF-től és nem mutatnak tüdőbetegséget, és akik független okból narkózison esnek át a KULeuven központban. Ezenkívül egy sor köpet (a CF-től és a kontroll betegektől) is elemezni kell. A kontroll alanyok COPD-s betegekből és egészséges alanyokból állnak (dohányzók vagy nem). Ezenkívül a CF-ből nasosinusális és rektális biopsziát is vesznek a nyálkahártya CF szöveteinek tüdőkörnyezeten kívüli vizsgálata céljából. A leolvasások mind a gén (RT-qPCR), mind a fehérje (immunhisztokémia, Western blot) szinten, valamint az IgA (immunhisztokémia, RT-qPCR az IgA1 és IgA2) szintjén egyaránt tartalmazzák a pIgR expressziót. Ezenkívül az (S-)IgA-t és az SC-t mérik a hörgőmosó folyadékokban és a köpetben.

   Globálisan, ha lehetséges, 30 explantátum, 30 endoszkópia és 150 köpet elemzését vártuk.

2. a légúti baktériumok elleni S-IgA antitestek értékelésére CF légutakban: Az S-IgA-hiány relevanciáját CF-ben az alsó légutak mikrobiális kolonizációja szempontjából értékeljük. Először is, az alacsony S-IgA szintek (mind a teljes IgA, mind a kórokozó-specifikus IgA) és a kórokozók – különösen a PA – általi kolonizáció közötti összefüggést vizsgálják CF-betegek köpetében és hörgőmosó folyadékaiban. Ezenkívül a tüdőexplantátumok esetében az S-IgA defektus és a PA festődés közötti regionális/térbeli kapcsolatot is figyelembe kell venni. Másodszor, a PA-specifikus IgA antitesteket hörgőmosásban és köpetfolyadékban vizsgálják, és korrelálják a kolonizációs adatokkal.
3. az S-IgA hiányának a tüdőpatológiához való hozzájárulásának értékelése CFTR KO egerekben: Az S-IgA hiány lehetséges hozzájárulását a CF tüdőbetegséghez in vivo CFTR KO egerek segítségével értékeljük. Mivel ezek a KO egerek nem foglalják össze a humán CF fenotípust, kihasználjuk kísérleti megfigyelésünket, miszerint az ismételt LPS-expozíció - amely COPD-szerű fenotípushoz vezet (Juanita és mtsai, 2002) - a pIgR/SC alulszabályozását eredményezi (lásd " Megszerzett eredmények"). Így értékelni fogjuk, hogy a krónikus LPS-expozíció által kiváltott pIgR-hiány elősegíti-e a CFTR KO egerekben a CF jellemzőkkel rendelkező tüdőpatológia kialakulását. Ennek megfelelően kettős (CFTR, pIgR) KO egerek hozhatók létre annak érdekében, hogy közvetlenül kezeljék a pIgR hiányának a tüdőpatológiához való hozzájárulását a CFTR mutációval összefüggésben. Ezen túlmenően egy másik, a tartós PA-fertőzést utánzó modellt (Martin és mtsai, 2011) alkalmaznak a PA hatásainak kezelésére CFTR és/vagy pIgR KO egerekben. A Beta-eNaC Tg egerek tüdõpatológiája kiindulási állapota van, és PA-fertõzés modellel (microbeads, Pr Burgel) is megszerezhetõek és megfertõzhetõk. A leolvasások magukban foglalják a hisztomorfológiai és biomolekuláris elemzéseket (gyulladásos és citokinválaszok), valamint a tüdőfunkciós teszteket (FlexiVent).
4. a pIgR downreguláció mechanizmusainak feltárása a CF epitéliumban: Mivel a CFBE 41o-sejtvonal (amely wt vagy mutáns F508del CFTR-t expresszál; Bruscia és mtsai, 2002) nem expresszál szignifikáns mértékű pIgR-t (lásd a „Kért eredmények”), ezért az elsődleges humán hörgőhám sejteket (HBEC) fogják használni annak értékelésére, hogy a pIgR leszabályozása megmarad-e az in vitro tenyésztett CF epitéliumban. A HBEC lég-folyadék határfelületén (ALI) elsődleges tenyésztést végeznek CF-betegekből a kontrollokhoz képest (a PI laboratóriumában futó protokoll COPD-ben; az EpithelixR sejtjeit is használják; valamint az orrban CF-ből származó sejtek (de Courcey és mtsai, 2012)). Az ALI tenyészetek lehetővé teszik a sejtfunkciók értékelését egy polarizált és helyreállított nyálkahártya-ciliáris légúti epitéliumban, akár nyugalmi állapotban, akár LPS és/vagy IL-1 által stimulált állapotban. Ha a pIgR expresszió in vitro a CF epitéliumban is csökken, az összefüggésben lehet a CFTR génhibával és/vagy a hám gyulladásos mikrokörnyezet általi in vivo imprintingjének epigenetikai memóriájával. Így ezeket a lehetőségeket CFTR-inhibitorok (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin és mtsai, 2013) alkalmazásával fogjuk megkülönböztetni. A pIgR diszfunkció másik poszt-transzkripciós mechanizmusa a sejtmembránhoz való helytelen címzés: az egyes receptorok (apikális CFTR, bazális pIgR) expressziójának zavara közötti kapcsolatot értékeljük. A leolvasások magukban foglalják a (szűrők) immunfestéssel és Western blot-tal, valamint RT-qPCR-rel értékelt pIgR expressziót. A pIgR funkcióját az ALI epitéliumnak a bazolaterálistól az apikális részig terjedő dimer IgA transzcitózására való képességének mérésével teszteljük. A CFTR (apikális) és a pIgR (bazális) membráncímzését konfokális mikroszkóppal vizsgáljuk.