Heikentynyt sekretorinen IgA ja limakalvon immuniteetti kystisessä fibroosissa (Forton2015)

Heikentynyt sekretorinen IgA ja limakalvon immuniteetti kystisessä fibroosissa:

CFTR:ään liittyvien epiteelimuutosten rooli pIgR-välitteisen IgA-transsytoosin säätelyssä ja vaikutus keuhkojen patologiaan ja heikentyneeseen puolustuskykyyn bakteeri-infektioita vastaan.

PROJEKTIN KUVAUS Kystinen fibroosi (CF) on yleisin kuolettava autosomaalinen resessiivinen sairaus valkoihoisilla väestössä, ja se vaikuttaa pääasiassa keuhkoihin. Kaksikymmentäneljä vuotta taudista vastuussa olevan geenin tunnistamisen jälkeen on edelleen monia kysymyksiä, nykyiset hoidot ovat oireenmukaisia ​​ja se on edelleen tappava sairaus. Se vaikuttaa CFTR-geeniin (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), joka koodaa hengitysteiden epiteelisolujen apikaalisella kalvolla ilmentyvää proteiinia, jossa se toimii cAMP-riippuvaisena kloridikanavana ja muiden kanavien säätelijänä, mukaan lukien epiteelin Na+-kanava (ENaC). . CFTR:n mutaatiot (F508del, 70 % tapauksista) johtavat joko toimintahäiriöön tai CFTR-proteiinin täydelliseen puuttumiseen apikaalisessa kalvossa, mikä johtuu proteiinin väärinlaskostumisesta ja pidättymisestä endoplasmisessa retikulumissa. Se johtaa epänormaalin viskoosiseen limaan, joka voi tukkia hengitystiet, suoliston luumenin ja rauhaskanavat (esim. haimassa) kloridin ulosvirtauksessa ja hydratoitumisessa. CFTR-häiriö johtaa myös epiteelin tulehdusta edistävään aktivaatioon (esim. NFkB:n kautta), mikä johtaa CXCL8/IL8:n vapautumiseen (Sloane et al, 2005) ja suojaavien tekijöiden, kuten a-defensiinien, tuotannon heikkenemiseen. Hengitysteiden kolonisaatio hengitysteissä ja keuhkoinfektiot ovat tämän taudin tunnusmerkki, erityisesti Pseudomonas aeruginosa (PA), joka vaikuttaa 70 %:iin CF-potilaista ja johon liittyy huonoja kliinisiä tuloksia. Patogeenien pysyvyyden taustalla olevat mekanismit CF-hengitystietissä ovat kuitenkin suurelta osin epäselviä.

Tämän projektin tavoitteena on tutkia, onko erittävän IgA:n (S-IgA) tuotanto heikentynyt CF-keuhkoissa, minkä mekanismien kautta ja edistääkö tämä vika CF:n patogeneesiä heikentämällä immuunisuojaa hengityselinten taudinaiheuttajia, kuten PA:ta, vastaan. S-IgA on tärkeä limakalvon puolustuslinja sisäänhengitettävien / nautittujen antigeenien ja patogeenien niin kutsutun immuuni-sulkemisen kautta (Norderhaug et ai., 1999). Sen jälkeen, kun subepiteliaaliset limakalvon plasmasolut ovat synteesiä polymeeristä (pääasiassa dimeeristä) IgA:ta, p-IgA kuljetetaan epiteelin läpi polymeerisen immunoglobuliinireseptorin (pIgR) välittämän solun läpi kulkevan reitityksen avulla. P-IgA sitoutuu pIgR:ään epiteelin basolateraalisessa navassa ja transsytooituu apikaaliseen napaan, jossa proteolyyttinen pilkkoutuminen vapauttaa pIgR:n solunulkoisen osan, jota kutsutaan erityskomponentiksi (SC), joka pysyy sitoutuneena p-IgA:han. muodostavat S-IgA:ta. Tämä kuljetus edustaa tärkeintä transsellulaarista reittiä kehossa (3 g/vrk). S-IgA:ta tuotetaan pääasiassa limakalvostimulaatiolla mikrobisignaaleilla, jotka vaikuttavat Toll-tyyppisten reseptorien kautta epiteelisoluihin ja B-soluihin (MacPherson et al, 2008), kun taas sytokiinit (IFN-g, IL-4, IL-1 tai TNF-a) voivat lisätä pIgR:n ilmentymistä ja/tai transsytoosia (katso katsaus Pilette et ai, 2001a).

Vika pIgR:n ilmentymisessä on tunnistettu savun aiheuttamassa kroonisessa obstruktiivisessa keuhkosairaudessa (COPD) (Pilette et ai, 2001b). Vähentynyt pIgR COPD:ssä voi johtua neutrofiiliperäisten seriiniproteinaasien aiheuttamasta hajoamisesta (Pilette et ai, 2003) sekä heikentyneestä geenin transkriptiosta (Gohy & Pilette, toimitettu käsikirjoitus). Toisin kuin keuhkoahtaumatauti, jää epäselväksi, vaikuttaako pIgR:n ilmentyminen CF:ssä, millä mekanismeilla ja jos on, millä seurauksilla limakalvon suojauksen kannalta. Hypoteesimme on, että pIgR:n ilmentyminen vähenee CF-epiteelissä CFTR:ään liittyvien epiteelimuutosten seurauksena ja johtaa heikentyneeseen IgA-välitteiseen hengitysteiden patogeenien immuunipuolustukseen, mikä edistää kroonista bakteerikolonisaatiota ja keuhkoinfektioita CF:ssä. Tämän hankkeen erityistavoitteet ovat seuraavat:

1. pIgR- ja IgA-ilmentymisen arvioimiseksi CF-potilaiden keuhkoputkikudoksessa verrokkeihin verrattuna. Tämä tehdään sekä keuhkoeksplanteilla CF-potilailta, joilla on loppuvaiheen keuhkosairaus (11 KULeuvenista ja 18 Pariisista, jo kerätty; verrattuna 7 eksplantaantiin kontrolleista ja keuhkokirurgisista näytteistä tupakoimattomilta) että keuhkoputkien biopsioissa. (n = 8) ja BAL (2 x 50 ml), joista otettiin näytteet transplantaatiota edeltävien bronkoskopioiden aikana (prospektiivinen näytteenotto, KULeuven). Kontrollihenkilöt ovat potilaita, joilla ei ole CF:ää ja joilla ei ole merkkejä keuhkosairaudesta ja jotka ovat riippumattomasta syystä narkoosissa KULeuven-keskuksessa. Lisäksi analysoidaan myös sarja ysköstä (CF-potilailta ja kontrollipotilailta). Kontrollihenkilöt koostuvat keuhkoahtaumatautipotilaista ja terveistä henkilöistä (tupakoivia tai ei). Lisäksi CF:stä otetaan myös nasosinaaliset ja peräsuolen biopsiat limakalvon CF-kudosten tutkimiseksi keuhkoympäristön ulkopuolella. Lukemat koostuvat pIgR:n ilmentymisestä sekä geenitasolla (RT-qPCR) että proteiinitasolla (immunohistokemia, Western blot) sekä IgA:sta (immunohistokemia, RT-qPCR IgA1:lle ja IgA2:lle). Lisäksi (S-)IgA ja SC mitataan keuhkoputkien huuhtelunesteistä ja ysköksestä.

   Maailmanlaajuisesti odotimme mahdollisuuksien mukaan analysoivamme 30 eksplanttia, 30 endoskopiaa ja 150 ysköstä.

2. arvioida S-IgA-vasta-aineita hengityselinten bakteereille CF-hengitystieissä: S-IgA-puutoksen merkitystä CF:ssä arvioidaan alempien hengitysteiden mikrobien kolonisaation suhteen. Ensinnäkin alhaisten S-IgA-tasojen (sekä kokonais-IgA että patogeenispesifinen IgA) ja patogeenien - erityisesti PA - kolonisaation välinen korrelaatio testataan CF-potilaiden ysköksessä ja keuhkoputkien huuhtelunesteissä. Lisäksi keuhkoeksplanteissa tarkastellaan myös alueellista/spatiaalista suhdetta S-IgA-virheen ja PA-värjäytymisen välillä. Toiseksi PA-spesifiset IgA-vasta-aineet määritetään keuhkoputken huuhtelussa ja yskösnesteissä, ja ne korreloidaan kolonisaatiotietoihin.
3. S-IgA-vajeen osuuden keuhkojen patologiaan CFTR KO -hiirillä arvioimiseksi: S-IgA-puutoksen mahdollinen vaikutus CF-keuhkosairauteen arvioidaan in vivo käyttäen CFTR KO -hiiriä. Koska nämä KO-hiiret eivät esitä uudelleen ihmisen CF-fenotyyppiä, hyödynnämme pilottihavaintoa, jonka mukaan toistuva LPS-altistus - joka johtaa COPD:n kaltaiseen fenotyyppiin (Juanita et al, 2002) - johtaa pIgR/SC:n alasäätelyyn (katso " Saadut tulokset"). Arvioimme siten, edistääkö kroonisen LPS-altistuksen aiheuttama pIgR-puutos CFTR KO -hiirillä keuhkopatologian kehittymistä, jossa on CF-ominaisuuksia. Näin ollen kaksinkertaisia ​​(CFTR, pIgR) KO-hiiriä voitiin tuottaa käsittelemään suoraan pIgR-puutoksen vaikutusta keuhkojen patologiaan CFTR-mutaation yhteydessä. Lisäksi toista mallia, joka jäljittelee jatkuvaa PA-infektiota (Martin et al, 2011), käytetään PA:n vaikutusten käsittelemiseen CFTR- ja/tai pIgR KO-hiirissä. Beta-eNaC Tg-hiirillä on perustason keuhkojen patologia, ja ne voidaan myös saada ja infektoida PA-infektion mallilla (mikrohelmet, Pr Burgel). Lukemiin kuuluvat histomorfologiset ja biomolekyylianalyysit (tulehdus- ja sytokiinivasteet) ja keuhkojen toimintatestit (FlexiVent).
4. pIgR:n alasäätelyn mekanismien tutkiminen CF-epiteelissä: Koska CFBE 41o-solulinja (ilmentää wt- tai mutantti-F508del CFTR:ää; Bruscia et al, 2002) ei ilmennä merkittäviä pIgR-tasoja (katso "Saadut tulokset"), ihmisen primaarinen keuhkoputken epiteeli soluja (HBEC) käytetään arvioimaan, säilyykö pIgR:n alasäätely CF-epiteelissä, jota viljellään in vitro. Primääriviljelmät HBEC:n ilma-nesterajapinnassa (ALI) suoritetaan CF-potilailta verrokkeihin verrattuna (nousu ja juoksu protokolla PI:n laboratoriossa COPD:ssä; käytetään myös EpithelixR:n soluja; samoin kuin nenän kautta solut CF:stä (de Courcey et al, 2012)). ALI-viljelmät mahdollistavat solutoimintojen arvioinnin polarisoidussa ja uudelleenmuodostetussa limakalvo-siliaarisessa hengitysteiden epiteelissä, joko lepotilassa tai LPS:n ja/tai IL-1:n stimuloimana. Jos pIgR:n ilmentyminen vähenee myös CF-epiteelissä in vitro, se voi liittyä joko CFTR-geenivirheeseen ja/tai epigeneettiseen muistiin tulehduksellisen mikroympäristön epiteelin in vivo -jäljennyksestä. Erottelemme siis nämä mahdollisuudet käyttämällä CFTR-estäjiä (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013). Toinen pIgR:n toimintahäiriön transkription jälkeinen mekanismi sisältää sen väärän osoitteen solukalvoon: kunkin reseptorin häiriintyneen ilmentymisen välinen suhde (apikaalinen CFTR, basaalinen pIgR) arvioidaan. Lukemat sisältävät pIgR:n ilmentymisen, joka on arvioitu immunovärjäyksellä (suodattimien) ja Western blotilla sekä RT-qPCR:llä. pIgR:n toiminta testataan mittaamalla ALI-epiteelin kyky transsytoosia dimeeristä IgA:ta basolateraalista apikaaliseen osastoon. CFTR:n (apikaalinen) ja pIgR:n (perus) kalvoosoitusta tutkitaan konfokaalimikroskopialla.