IgA sécrétoires altérées et immunité muqueuse dans la fibrose kystique (Forton2015)

Altération des IgA sécrétoires et de l'immunité muqueuse dans la mucoviscidose :

rôle des modifications épithéliales liées au CFTR dans la régulation de la transcytose des IgA médiées par les pIgR et contribution à la pathologie pulmonaire et à la défense altérée contre les infections bactériennes.

DESCRIPTION DU PROJET La fibrose kystique (FK) représente la maladie autosomique récessive létale la plus courante dans la population blanche, affectant principalement les poumons. Vingt-quatre ans après l'identification du gène responsable de la maladie, de nombreuses questions subsistent, les traitements actuels sont symptomatiques et cela reste une maladie mortelle. Il affecte le gène régulateur transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), qui code pour une protéine exprimée sur la membrane apicale des cellules épithéliales des voies respiratoires, où il agit comme un canal chlorure dépendant de l'AMPc et un régulateur d'autres canaux, y compris le canal épithélial Na+ (ENaC) . Les mutations du CFTR (F508del, 70% des cas) entraînent soit un dysfonctionnement, soit une absence totale de la protéine CFTR au niveau de la membrane apicale, en raison d'un mauvais repliement et d'une rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique. Il en résulte des défauts d'efflux de chlorure et d'hydratation du liquide de la muqueuse épithéliale, entraînant un mucus anormalement visqueux qui peut obstruer les voies respiratoires, la lumière intestinale et les canaux glandulaires (par exemple dans le pancréas). Le dysfonctionnement du CFTR conduit également à une activation pro-inflammatoire (par exemple via NFkB) de l'épithélium, entraînant la libération de CXCL8/IL8 (Sloane et al, 2005) et une altération de la production de facteurs protecteurs tels que les a-défensines. La colonisation des voies respiratoires et les infections pulmonaires sont une caractéristique de cette maladie, en particulier avec Pseudomonas aeruginosa (PA) qui affecte 70 % des patients atteints de mucoviscidose et est associée à de mauvais résultats cliniques. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la persistance des agents pathogènes dans les voies respiratoires de la mucoviscidose restent largement flous.

Ce projet vise à déterminer si la production d'IgA sécrétoires (S-IgA) est altérée dans le poumon FK, par quels mécanismes, et si ce défaut contribue à la pathogenèse de la FK en altérant l'immunoprotection contre les agents pathogènes respiratoires tels que l'AP. La S-IgA est une ligne majeure de défense des muqueuses, par ce que l'on appelle l'exclusion immunitaire des antigènes et pathogènes inhalés/ingérés (Norderhaug et al, 1999). Suite à la synthèse d'IgA polymères (principalement dimériques) par les plasmocytes de la muqueuse sous-épithéliale, la p-IgA est transportée à travers l'épithélium par un routage transcellulaire médié par le récepteur d'immunoglobuline polymère (pIgR). La P-IgA se lie au pIgR au pôle basolatéral de l'épithélium, et est transcytosée jusqu'au pôle apical, où un clivage protéolytique libère la partie extracellulaire du pIgR, appelée composant sécrétoire (SC) qui reste liée au p-IgA pour forme S-IgA. Ce transport représente le routage transcellulaire le plus important dans l'organisme (3g/jour). La S-IgA est principalement produite lors de la stimulation muqueuse par des signaux microbiens agissant via des récepteurs de type Toll sur les cellules épithéliales et les cellules B (MacPherson et al, 2008) tandis que les cytokines (IFN-g, IL-4, IL-1 ou TNF-a) peut réguler à la hausse l'expression de pIgR et/ou la transcytose (voir revue Pilette et al, 2001a).

Un défaut d'expression de pIgR a été identifié dans la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) induite par la fumée (Pilette et al, 2001b). La réduction du pIgR dans la MPOC pourrait être due à la dégradation par les sérine protéinases dérivées des neutrophiles (Pilette et al, 2003), ainsi qu'à une transcription génique altérée (Gohy & Pilette, manuscrit soumis). Contrairement à la BPCO, on ne sait toujours pas si l'expression de pIgR est affectée dans la mucoviscidose, par quels mécanismes, et si oui, avec quelles conséquences en termes de défense muqueuse. Notre hypothèse est que l'expression de pIgR est réduite dans les épithéliums de mucoviscidose, à la suite de changements épithéliaux liés au CFTR, et conduit à une altération de l'exclusion immunitaire médiée par les IgA des agents pathogènes respiratoires, favorisant ainsi la colonisation bactérienne chronique et les infections pulmonaires dans la mucoviscidose. Les objectifs spécifiques de ce projet sont les suivants :

1. pour évaluer l'expression de pIgR et IgA dans le tissu bronchique de patients atteints de mucoviscidose, par rapport aux témoins. Cela sera réalisé à la fois sur des explants pulmonaires de patients mucoviscidose atteints d'une maladie pulmonaire en phase terminale (11 de la KULeuven et 18 de Paris, déjà collectés ; par rapport à 7 explants de témoins et à des prélèvements chirurgicaux pulmonaires de non-fumeurs) et sur des biopsies bronchiques (n=8) et BAL (2x50mL) prélevés lors des bronchoscopies pré-transplantation (prélèvement prospectif, KULeuven). Les sujets témoins seront des patients sans mucoviscidose et sans signe de maladie pulmonaire et qui subissent une narcose pour une raison indépendante au centre KULeuven. En outre, une série d'expectorations (provenant de patients atteints de mucoviscidose et de patients témoins) seront également analysées. Les sujets témoins seront constitués de patients BPCO et de sujets sains (fumeurs ou non). De plus, des biopsies nasosinusales et rectales de mucoviscidose seront également obtenues, afin d'étudier les tissus mucosaux de mucoviscidose en dehors de l'environnement pulmonaire. Les lectures consisteront en l'expression de pIgR au niveau des gènes (RT-qPCR) et des protéines (immunohistochimie, western blot), ainsi que pour les IgA (immunohistochimie, RT-qPCR pour IgA1 et IgA2). De plus, les (S-)IgA et SC seront mesurés dans les liquides de lavage bronchique et dans les expectorations.

   Globalement, nous prévoyons si possible d'analyser 30 explants, 30 endoscopies et 150 crachats.

2. pour évaluer les anticorps S-IgA dirigés contre les bactéries respiratoires dans les voies respiratoires FK : la pertinence du déficit en S-IgA dans la FK sera évaluée en ce qui concerne la colonisation microbienne des voies respiratoires inférieures. Tout d'abord, la corrélation entre les faibles niveaux de S-IgA (à la fois IgA totales et IgA spécifiques des agents pathogènes) et la colonisation par des agents pathogènes - en particulier PA - sera testée dans les expectorations et les fluides de lavage bronchique des patients atteints de mucoviscidose. En outre, dans les explants pulmonaires, une relation régionale/spatiale entre le défaut S-IgA et la coloration PA sera également abordée. Deuxièmement, les anticorps IgA spécifiques de l'AP seront dosés dans les fluides de lavage bronchique et d'expectoration, et corrélés aux données de colonisation.
3. pour évaluer la contribution du défaut en S-IgA à la pathologie pulmonaire chez les souris CFTR KO : la contribution potentielle du déficit en S-IgA à la maladie pulmonaire CF sera évaluée in vivo, en utilisant des souris CFTR KO. Comme ces souris KO ne récapitulent pas le phénotype CF humain, nous tirerons parti de notre observation pilote selon laquelle une exposition répétée au LPS - qui conduit à un phénotype de type MPOC (Juanita et al, 2002) - entraîne une régulation négative de pIgR/SC (voir " Les résultats obtenus"). Nous évaluerons ainsi si le déficit en pIgR induit lors d'une exposition chronique au LPS favorise chez les souris CFTR KO le développement d'une pathologie pulmonaire avec des caractéristiques CF. En conséquence, des souris KO doubles (CFTR, pIgR) pourraient être générées pour traiter directement la contribution du déficit en pIgR à la pathologie pulmonaire en conjonction avec la mutation CFTR. De plus, un deuxième modèle imitant l'infection persistante à PA (Martin et al, 2011) sera utilisé pour traiter les effets du PA chez les souris CFTR et/ou pIgR KO. Les souris Beta-eNaC Tg ont une pathologie pulmonaire de base et pourraient également être obtenues et infectées par un modèle d'infection PA (microbilles, Pr Burgel). Les lectures comprendront des analyses histomorphologiques et biomoléculaires (réponses inflammatoires et cytokines) et des tests de la fonction pulmonaire (FlexiVent).
4. pour explorer les mécanismes de la régulation à la baisse de pIgR dans l'épithélium FK : Comme la lignée cellulaire CFBE 41o (exprimant wt ou mutant F508del CFTR ; Bruscia et al, 2002) n'exprime pas de niveaux significatifs de pIgR (voir "Résultats obtenus"), l'épithélium bronchique humain primaire (HBEC) seront utilisées pour évaluer si la régulation négative de pIgR est maintenue dans l'épithélium CF cultivé in vitro. Des cultures primaires dans l'interface air-liquide (ALI) de HBEC seront réalisées à partir de patients atteints de mucoviscidose, par rapport aux témoins (protocole de mise en place dans le laboratoire de l'IP dans la MPOC ; des cellules d'EpithelixR seront également utilisées ; ainsi que des tests nasaux cellules de CF (de Courcey et al, 2012)). Les cultures ALI permettent d'évaluer les fonctions cellulaires dans un épithélium bronchique muco-ciliaire polarisé et reconstitué, au repos ou stimulé par le LPS et/ou l'IL-1. Si l'expression de pIgR est également diminuée dans l'épithélium CF in vitro, cela pourrait être lié soit au défaut du gène CFTR et/ou à la mémoire épigénétique de l'empreinte in vivo de l'épithélium par le microenvironnement inflammatoire. Nous distinguerons donc ces possibilités en utilisant des inhibiteurs de CFTR (CFTR-inh172, PPQ-102 ; Martin et al, 2013). Un autre mécanisme post-transcriptionnel du dysfonctionnement de pIgR est son mauvais adressage à la membrane cellulaire : la relation entre l'expression perturbée de chaque récepteur (CFTR apical, pIgR basal) sera évaluée. Les lectures incluront l'expression de pIgR évaluée par immunocoloration (des filtres) et western blot, et par RT-qPCR. La fonction du pIgR sera testée en mesurant la capacité de l'épithélium ALI à transcytoser les IgA dimériques du basolatéral vers le compartiment apical. L'adressage membranaire du CFTR (apical) et du pIgR (basal) sera étudié par microscopie confocale.