Beeinträchtigte sekretorische IgA- und Schleimhautimmunität bei zystischer Fibrose (Forton2015)

Beeinträchtigte sekretorische IgA- und Schleimhautimmunität bei Mukoviszidose:

Rolle von CFTR-bedingten epithelialen Veränderungen bei der Regulation von pIgR-vermittelter IgA-Transzytose und Beitrag zur Lungenpathologie und beeinträchtigter Abwehr gegen bakterielle Infektionen.

PROJEKTBESCHREIBUNG Zystische Fibrose (CF) ist die häufigste letale autosomal-rezessive Erkrankung in der weißen Bevölkerung, die hauptsächlich die Lunge betrifft. Vierundzwanzig Jahre nach der Identifizierung des für die Krankheit verantwortlichen Gens bleiben viele Fragen offen, die derzeitigen Behandlungen sind symptomatisch und es bleibt eine tödliche Krankheit. Es wirkt sich auf das CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) aus, das für ein Protein kodiert, das auf der apikalen Membran von Atemwegsepithelzellen exprimiert wird, wo es als cAMP-abhängiger Chloridkanal und Regulator anderer Kanäle, einschließlich des epithelialen Na+-Kanals (ENaC), fungiert. . Mutationen des CFTR (F508del, 70 % der Fälle) führen aufgrund von Proteinfehlfaltung und -retention im endoplasmatischen Retikulum entweder zu einer Fehlfunktion oder zum vollständigen Fehlen des CFTR-Proteins an der apikalen Membran. Es führt zu Störungen des Chloridausflusses und der Hydratation der epithelialen Auskleidungsflüssigkeit, was zu abnorm viskosem Schleim führt, der die Atemwege, das Darmlumen und die Drüsengänge (z. B. in der Bauchspeicheldrüse) verstopfen kann. Eine CFTR-Dysfunktion führt auch zu einer proinflammatorischen Aktivierung (z. B. durch NFkB) des Epithels, was zu einer Freisetzung von CXCL8/IL8 (Sloane et al., 2005) und einer beeinträchtigten Produktion von Schutzfaktoren wie a-Defensinen führt. Die Kolonisierung der Atemwege und Lungeninfektionen sind ein Kennzeichen dieser Krankheit, insbesondere mit Pseudomonas aeruginosa (PA), die 70 % der CF-Patienten betrifft und mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden ist. Die Mechanismen, die der Persistenz von Krankheitserregern in CF-Atemwegen zugrunde liegen, bleiben jedoch weitgehend unklar.

Dieses Projekt soll untersuchen, ob die Produktion von sekretorischem IgA (S-IgA) in der CF-Lunge durch welche Mechanismen beeinträchtigt ist und ob dieser Defekt zur Pathogenese von CF beiträgt, indem er die Immunprotektion gegen respiratorische Pathogene wie PA beeinträchtigt. S-IgA ist eine Hauptlinie der Schleimhautabwehr durch den sogenannten Immunausschluss von eingeatmeten/aufgenommenen Antigenen und Krankheitserregern (Norderhaug et al., 1999). Nach der Synthese von polymerem (hauptsächlich dimerem) IgA durch subepitheliale Schleimhautplasmazellen wird p-IgA über das Epithel durch einen transzellulären Weg transportiert, der durch den polymeren Immunglobulinrezeptor (pIgR) vermittelt wird. P-IgA bindet an den pIgR am basolateralen Pol des Epithels und wird bis zum apikalen Pol transzytiert, wo eine proteolytische Spaltung den extrazellulären Teil des pIgR freisetzt, der als sekretorische Komponente (SC) bezeichnet wird und an p-IgA gebunden bleibt bilden S-IgA. Dieser Transport stellt die wichtigste transzelluläre Route im Körper dar (3 g/Tag). S-IgA wird hauptsächlich nach Schleimhautstimulation durch mikrobielle Signale produziert, die über Toll-like-Rezeptoren auf Epithelzellen und B-Zellen wirken (MacPherson et al., 2008), während Zytokine (IFN-g, IL-4, IL-1 oder TNF-a) kann die pIgR-Expression und/oder Transzytose hochregulieren (siehe Review Pilette et al., 2001a).

Ein Defekt der pIgR-Expression wurde bei rauchinduzierter chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) identifiziert (Pilette et al., 2001b). Reduzierter pIgR bei COPD könnte auf den Abbau durch von Neutrophilen stammende Serinproteinasen (Pilette et al., 2003) sowie auf eine beeinträchtigte Gentranskription (Gohy & Pilette, eingereichtes Manuskript) zurückzuführen sein. Im Gegensatz zur COPD bleibt unklar, ob die pIgR-Expression bei CF beeinflusst wird, durch welche Mechanismen und wenn ja, mit welchen Folgen für die Schleimhautabwehr. Unsere Hypothese ist, dass die pIgR-Expression in CF-Epithelien infolge von CFTR-bedingten Epithelveränderungen reduziert ist und zu einer Beeinträchtigung des IgA-vermittelten Immunausschlusses von Atemwegserregern führt, wodurch eine chronische bakterielle Besiedelung und Lungeninfektionen bei CF begünstigt werden. Die spezifischen Ziele dieses Projekts sind wie folgt:

1. zur Bewertung der pIgR- und IgA-Expression im Bronchialgewebe von CF-Patienten im Vergleich zu Kontrollen. Dies wird sowohl an Lungenexplantaten von CF-Patienten mit Lungenerkrankungen im Endstadium (11 von KULeuven und 18 aus Paris, bereits gesammelt; im Vergleich zu 7 Explantaten von Kontrollen und lungenchirurgischen Proben von Nichtrauchern) als auch in Bronchialbiopsien durchgeführt (n = 8) und BAL (2 x 50 ml), die während Bronchoskopien vor der Transplantation entnommen wurden (prospektive Probenahme, KULeuven). Kontrollpersonen sind Patienten ohne CF und ohne Anzeichen einer Lungenerkrankung, die sich aus einem unabhängigen Grund im KULeuven-Zentrum einer Narkose unterziehen. Zusätzlich wird auch eine Reihe von Sputum (von CF- und Kontrollpatienten) analysiert. Kontrollpersonen bestehen aus COPD-Patienten und gesunden Personen (Raucher oder Nichtraucher). Darüber hinaus werden auch nasosinusale und rektale Biopsien von CF entnommen, um Mukosal-CF-Gewebe außerhalb der Lungenumgebung zu untersuchen. Auslesungen bestehen aus der pIgR-Expression sowohl auf Gen- (RT-qPCR) und Proteinebene (Immunhistochemie, Western Blot) als auch für IgA (Immunhistochemie, RT-qPCR für IgA1 und IgA2). Zusätzlich werden (S-)IgA und SC in Bronchialspülflüssigkeiten und im Sputum gemessen.

   Weltweit erwarteten wir, wenn möglich, 30 Explantate, 30 Endoskopien und 150 Sputum zu analysieren.

2. Bewertung von S-IgA-Antikörpern gegen Atemwegsbakterien in CF-Atemwegen: Die Relevanz eines S-IgA-Mangels bei CF wird im Hinblick auf die mikrobielle Besiedlung der unteren Atemwege bewertet. Zunächst wird die Korrelation zwischen niedrigen S-IgA-Spiegeln (sowohl Gesamt-IgA als auch erregerspezifisches IgA) und der Besiedelung durch Krankheitserreger – insbesondere PA – im Sputum und in Bronchialspülflüssigkeiten von CF-Patienten getestet. Darüber hinaus wird bei Lungenexplantaten auch ein regionaler/räumlicher Zusammenhang zwischen S-IgA-Defekt und PA-Färbung thematisiert. Zweitens werden PA-spezifische IgA-Antikörper in Bronchialspülungen und Sputumflüssigkeiten getestet und mit den Kolonisierungsdaten korreliert.
3. Bewertung des Beitrags des S-IgA-Defekts zur Lungenpathologie bei CFTR-KO-Mäusen: Der potenzielle Beitrag des S-IgA-Mangels zur CF-Lungenerkrankung wird in vivo unter Verwendung von CFTR-KO-Mäusen bewertet. Da diese KO-Mäuse den menschlichen CF-Phänotyp nicht rekapitulieren, werden wir unsere Pilotbeobachtung nutzen, dass eine wiederholte LPS-Exposition – die zu einem COPD-ähnlichen Phänotyp führt (Juanita et al., 2002) – zu einer Herunterregulierung von pIgR/SC führt (siehe „ Ergebnisse erhalten"). Wir werden daher untersuchen, ob pIgR-Mangel, der durch chronische LPS-Exposition induziert wird, bei CFTR-KO-Mäusen die Entwicklung einer Lungenpathologie mit CF-Merkmal fördert. Dementsprechend könnten doppelte (CFTR, pIgR) KO-Mäuse erzeugt werden, um den Beitrag des pIgR-Mangels zur Lungenpathologie in Verbindung mit der CFTR-Mutation direkt zu adressieren. Darüber hinaus wird ein zweites Modell, das eine persistierende PA-Infektion nachahmt (Martin et al., 2011), verwendet, um die Auswirkungen von PA bei CFTR- und/oder pIgR-KO-Mäusen zu untersuchen. Beta-eNaC Tg-Mäuse haben eine grundlegende Lungenpathologie und könnten auch durch ein Modell einer PA-Infektion (Mikroperlen, Pr Burgel) erhalten und infiziert werden. Die Auswertungen umfassen histomorphologische und biomolekulare Analysen (Entzündungs- und Zytokinreaktionen) und Lungenfunktionstests (FlexiVent).
4. um die Mechanismen der pIgR-Herunterregulierung im CF-Epithel zu untersuchen: Da die CFBE 41o-Zelllinie (die wt oder mutierte F508del CFTR exprimiert; Bruscia et al., 2002) keine signifikanten Mengen an pIgR exprimiert (siehe „Erzielte Ergebnisse“), primäres menschliches Bronchialepithel Zellen (HBEC) werden verwendet, um zu beurteilen, ob die pIgR-Herunterregulierung in dem in vitro kultivierten CF-Epithel aufrechterhalten wird. Primärkulturen in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) von HBEC werden von CF-Patienten im Vergleich zu Kontrollen durchgeführt (aktuelles Protokoll im Labor des PI bei COPD; Zellen von EpithelixR werden ebenfalls verwendet; sowie nasale Zellen aus CF (de Courcey et al, 2012)). ALI-Kulturen ermöglichen die Bewertung von Zellfunktionen in einem polarisierten und rekonstituierten mukoziliären Atemwegsepithel, das entweder ruht oder durch LPS und/oder IL-1 stimuliert wird. Wenn die pIgR-Expression auch im CF-Epithel in vitro verringert ist, könnte dies entweder mit dem CFTR-Gendefekt und/oder mit dem epigenetischen Gedächtnis der in vivo-Prägung des Epithels durch die entzündliche Mikroumgebung zusammenhängen. Wir werden daher diese Möglichkeiten durch die Verwendung von CFTR-Inhibitoren (CFTR-inh172, PPQ-102; Martin et al, 2013) unterscheiden. Ein weiterer posttranskriptioneller Mechanismus der pIgR-Dysfunktion ist die falsche Adressierung der Zellmembran: Die Beziehung zwischen der gestörten Expression jedes Rezeptors (apikaler CFTR, basaler pIgR) wird evaluiert. Die Ablesungen umfassen die durch Immunfärbung (von Filtern) und Western Blot sowie durch RT-qPCR bewertete pIgR-Expression. Die Funktion des pIgR wird getestet, indem die Fähigkeit des ALI-Epithels gemessen wird, dimeres IgA vom basolateralen zum apikalen Kompartiment zu transzytieren. Die Membranadressierung von CFTR (apikal) und pIgR (basal) wird durch konfokale Mikroskopie untersucht.