小児肥満に対する食事栄養介入手法に関する研究

学力試験の前に、保護者への手紙、インフォームドコンセント、ボランティアアンケートが児童とその保護者に公開されます。 私たちはボランティアとその保護者にこの研究について説明し、この研究に参加するよう勧めます。 研究対象に参加できるのは、保護者への手紙に署名し、インフォームド・コンセントをとったボランティアと保護者だけです。

実験手順：

実験研究全体には、2回の健康診断、血液および便サンプルの採取が必要です。 初回試験とサンプル収集は学科試験中に行われます。 2 回目は介入後に続行されます。

研究対象者の募集：

学力検査とボランティアのアンケートによると、3か月前に抗生物質を服用しておらず、BMIが肥満の範囲内にある健康な子供約300名が集められました。 次に、腹囲と体脂肪率を測定します。 ウエストサイズと体重の比率が >0.46 で、体脂肪率が高い場合 (男子および 12 歳未満の女子では >20%、12 歳未満の女子では >25%)、データが収集されて入力されます。データベースに。 15～18歳の健康な子供約40人が次の介入研究に参加するために募集される。

一般的な身体検査：

学力検査では、身長や体重などの基本的な医学的データが記録され、BMIが計算されます。 BMI が肥満の範囲にある場合、体組成が測定され記録されます。

MRI および MRS 検査:

すべての患者は、経験豊富な技術者によって 3 テスラ MR ユニット (MAGNETOM Skyra、Siemens Healthcare、エアランゲン、ドイツ) を使用して MRI スキャンを受けました。 MRI と MRS は、それぞれマルチエコー Dixon シーケンスと HISTO シーケンスで実行され、肝陽子密度脂肪率 (PDFF) が計算されました。

採血、保存、検査：

採血と保存は健康診断の標準で行われます。 肥満のデータを収集する場合、肥満の小児については、血球数、血糖、血清脂質、肝機能の検査を処理する必要があります。 介入する場合は、血球数、血糖、血中脂質、肝機能、ヘモグロビン、サイトカイン、インスリン、高感度C反応性タンパク質、レプチン、ソマトメジンCなどのより多くの検査を処理する必要があります。

便の収集、保存、検出:

50 ml 遠心分離管を使用して便サンプルを収集します。 各チューブには、ボランティアに対応する固有のエンコーディングがマークされています。 ボランティアが便サンプルを収集するときは、できるだけ早く滅菌綿棒または爪楊枝を使用して、便サンプルを滅菌遠心分離管に移します。 採取サンプルは10g以上となります。 遠心管は低温の場所に置き、その後冷蔵庫に移し、DNA抽出やその他の検査を行うまで-80℃で保管してください。 短鎖脂肪酸含量 (SCFA)、pH、水分含量、免疫因子 sIgA およびカルプロテクチンなどの検査が処理されます。

便中の細菌の 16S rRNA 遺伝子配列決定:

DNA抽出:

各サンプルについて、約 0.2g の糞便の重量を量り、糞便ゲノム DNA 抽出キット (Qiagen、モデル DP328) を使用して全 DNA を抽出します。 次に、NanoDrop (Thermo、2000C) を使用して抽出された DNA の濃度と純度を測定し、各サンプルが配列決定要件を満たしていることを保証しました。

サンプルのシーケンス:

16S rRNA 遺伝子 (V3 ～ V4) の PCR 増幅は、ユニバーサル フォワード プライマー 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' およびリバース プライマー 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3' を使用して実行されます。 増幅システムには、滅菌水19.375μl、緩衝液2.5μl、鋳型1μl、プライマー1μl、Pyrobest DNAポリメラーゼ0.125μlが含まれる。 PCRサイクル条件は以下の通り:94℃5分、その後94℃で30秒変性、50℃で30秒復元、72℃で30秒伸長、その後72℃で5分間伸長を含むいくつかのサイクルを行った。 PCR 製品の電気泳動は、さまざまな適用サイクルで適切な PCR 製品を決定するために実行されます。 増幅産物をタグ付きプライマーおよび標識に接続した後、Illumina MiSeq のシーケンスプラットフォームを使用してペアエンドシーケンスが実行され、リード長は約 250 bp です。

PFE による小児肥満に対する介入治療:

16S rRNA 遺伝子配列決定後、同様の腸内細菌叢プロフィールを持つ高校生の肥満ボランティア約 40 名が介入治療研究に参加するために選ばれます。 介在する食べ物は『Dr. エフライム」植物発酵エキス（PFE）。 研究対象者の以前の食事を変えることなく、各研究対象は朝と夕方にそれぞれ30mLのPFEを飲み、介入は8週間続きます。 8週間の介入の前後に、研究対象の便と血液のサンプルが収集および分析され、生理学的および生化学的指標が得られます。 各段階の糞便サンプルのすべての 16S rRNA 遺伝子が配列決定されます。