Studie o intervenčních technikách dietní výživy pro dětskou obezitu

Před akademickou zkouškou je školním dětem a jejich zákonným zástupcům poskytnut dopis rodičům, informovaný souhlas a dobrovolnický dotazník. Řekneme dobrovolníkům a jejich opatrovníkům, co o této studii, a zveme je k účasti na této studii. Pouze dobrovolníci a opatrovníci podepsaný na dopise rodičům a informovaný souhlas mohou zkoumat předměty.

Experimentální postupy:

Pro celý výzkum experimentu jsou vyžadovány dvakrát lékařské prohlídky, odběr vzorků krve a stolice. První zkoušky a odběr vzorků se provádí během akademické zkoušky; podruhé se provádí po zásahu.

Nábor výzkumných objektů:

Podle akademického vyšetření a dotazníků dobrovolníků bylo přijato asi 300 zdravých dětí, které neužívaly antibiotika do 3 měsíců, a jejich BMI by mělo být v rozmezí obezity. Poté se změří jejich obvod pasu a poměr tělesného tuku. Pokud je poměr velikosti pasu k váze >0,46 a mají vyšší procento tělesného tuku (>20 % u chlapců a dívek mladších 12 let, >25 % u dívek ve věku 12 let), údaje se shromáždí a zadají do databáze. K účasti na dalším intervenčním výzkumu je vybráno asi 40 zdravých dětí ve věku 15-18 let.

Celkové vyšetření těla:

Při akademické zkoušce jsou zaznamenány základní zdravotní údaje studenta včetně výšky a hmotnosti a následně je vypočítán jeho BMI. Pokud je jeho BMI v rozmezí obezity, změří se a zaznamená se složení jeho těla.

MRI a MRS test:

Všichni pacienti podstoupili MRI skenování provedené zkušeným technologem na MR jednotce 3 Tesla (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Německo). MRI a MRS byly provedeny s multi-echo Dixonovými a HISTO sekvencemi, v tomto pořadí, pro výpočet frakce tuku s hustotou protonů v játrech (PDFF).

Odběr, konzervace a vyšetření krve:

Odběr a konzervace krve probíhá standardně při lékařském vyšetření. Při sběru dat o obezitě by měly být u obézních dětí zpracovány testy krevního obrazu, glukózy v krvi, sérových lipidů a jaterních funkcí. Při zásahu by mělo být zpracováno více testů včetně krevního obrazu, glukózy v krvi, krevních lipidů, jaterních funkcí, hemoglobinu, cytokinů, inzulínu, vysoce senzitivního C-reaktivního proteinu, leptinu a somatomedinu C.

Odběr, konzervace a detekce stolice:

K odběru vzorků stolice se používají centrifugační zkumavky o objemu 50 ml. Každá zkumavka je označena jedinečným kódováním, které odpovídá dobrovolníkovi. Když dobrovolníci odebírají vzorky stolice, přenesou vzorky stolice co nejdříve do sterilní centrifugační zkumavky pomocí sterilních tamponů nebo párátek. Odebírané vzorky by měly být větší než 10 g. Centrifugační zkumavky by měly být umístěny na místo s nízkou teplotou, poté přemístěny do chladničky a skladovány při teplotě -80 ℃ až do extrakce DNA a dalšího testování. Jsou zpracovány testy zahrnující obsah mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA), pH, obsah vody, imunitní faktory sIgA a kalprotektin.

Sekvenování genu 16S rRNA bakterií ve stolici:

Extrakce DNA:

Pro každý vzorek se zváží asi 0,2 g stolice a celková DNA se extrahuje pomocí soupravy pro extrakci fekální genomické DNA (Qiagen, model DP328). A poté byla měřena koncentrace a čistota extrahované DNA pomocí NanoDrop (Thermo, 2000C), aby bylo zaručeno, že každý vzorek splňuje požadavky na sekvenování.

Ukázkové sekvenování:

PCR amplifikace genu 16S rRNA (V3-V4) jsou prováděny s univerzálními dopřednými primery 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' a reverzním primerem 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. Amplifikační systém zahrnuje sterilní vodu 19,375 ul, pufr 2,5 ul, templát 1 ul, primery 1 ul, Pyrobest DNA polymerázu 0,125 ul. Podmínky cyklování PCR byly následující: 94 °C 5 minut, následovaly některé cykly včetně denaturace 94 °C po dobu 30 s, renaturace 50 °C po dobu 30 s, prodloužení 72 °C po dobu 30 s, poté prodloužení 72 °C po dobu 5 minut. Elektroforéza produktu PCR se provádí za účelem stanovení vhodného produktu PCR s různými aplikačními cykly. Po připojení amplifikovaných produktů k značeným primerům a značkám se provádí sekvenování na párovém konci se sekvenační platformou Illumina MiSeq a délka čtení je asi 250 bp.

Intervenční léčba dětské obezity s PFE:

Po sekvenování genu 16S rRNA je vybráno asi 40 obézních dobrovolníků na střední škole a s podobnými profily střevní flóry, aby se zúčastnili výzkumu intervenční léčby. Zasahujícím jídlem je „Dr. Ephraim" rostlinný fermentační extrakt (PFE). Beze změny předchozí stravy výzkumných objektů každý výzkumný objekt vypije 30 ml PFE při ranních a večerních enzymech a intervence trvá 8 týdnů. Před a po 8týdenní intervenci jsou odebrány a analyzovány vzorky stolice a krve výzkumných objektů, aby se získaly jejich fyziologické a biochemické indexy. Všechen gen 16S rRNA vzorků stolice v každém stádiu je sekvenován.