Studio sulle tecniche di intervento nutrizionale dietetico per l'obesità infantile

Prima dell'esame accademico, ai bambini delle scuole e ai loro tutori vengono rilasciati la lettera ai genitori, il consenso informato e il questionario del volontario. Raccontiamo ai volontari e ai loro tutori cosa c'è di questo studio e li invitiamo a partecipare a questo studio. Solo i volontari e i tutori firmano sulla lettera ai genitori e il consenso informato possono accedere agli oggetti di ricerca.

Procedure sperimentali:

Per l'intera ricerca dell'esperimento sono necessari due tempi di esami medici, raccolta di campioni di sangue e feci. La prima volta che gli esami e la raccolta dei campioni vengono svolti durante l'esame accademico; la seconda volta viene portata avanti dopo l'intervento.

Reclutamento di oggetti di ricerca:

Secondo l'esame accademico e i questionari dei volontari, vengono reclutati circa 300 bambini sani che non hanno assunto antibiotici prima di 3 mesi e il loro indice di massa corporea dovrebbe essere nella fascia di obesità. Quindi vengono misurati la circonferenza della vita e il rapporto tra grasso corporeo. Se il rapporto tra girovita e peso è >0,46 e hanno una percentuale di grasso corporeo maggiore (>20% per ragazzi e ragazze sotto i 12 anni, >25% per ragazze di 12 anni), i dati vengono raccolti e inseriti alla banca dati. Circa 40 bambini sani tra i 15 ei 18 anni vengono reclutati per partecipare alla prossima ricerca di intervento.

Esame generale del corpo:

Nell'esame accademico, vengono registrati i dati medici di base dello studente, inclusi altezza e peso, e quindi viene calcolato il suo indice di massa corporea. Se il suo indice di massa corporea rientra nell'intervallo di obesità, la sua composizione corporea viene misurata e registrata.

Test MRI e MRS:

Tutti i pazienti sono stati sottoposti a scansione MRI eseguita da un tecnico esperto utilizzando un'unità RM da 3 Tesla (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Germania). MRI e MRS sono stati eseguiti con sequenze multi-echo Dixon e HISTO, rispettivamente, per calcolare la frazione di grasso della densità protonica epatica (PDFF).

Prelievo, conservazione e analisi del sangue:

La raccolta e la conservazione del sangue procedono secondo lo standard della visita medica. Quando si raccolgono i dati sull'obesità, per i bambini obesi dovrebbero essere elaborati i test dell'emocromo, della glicemia, dei lipidi sierici e della funzionalità epatica. Quando si interviene, devono essere elaborati più test tra cui emocromo, glicemia, lipidi nel sangue, funzionalità epatica, emoglobina, citochine, insulina, proteina C-reattiva ad alta sensibilità, leptina e somatomedina C.

Raccolta, conservazione e rilevamento delle feci:

Le provette da centrifuga da 50 ml vengono utilizzate per raccogliere campioni di feci. Ogni tubo è contrassegnato da una codifica univoca corrispondente a un volontario. Quando i volontari raccolgono campioni di feci, trasferiscono i campioni di feci in una provetta da centrifuga sterile utilizzando tamponi sterili o stuzzicadenti il ​​prima possibile. I campioni di raccolta devono essere superiori a 10 g. Le provette da centrifuga devono essere poste in un luogo a bassa temperatura, quindi trasferite in frigorifero e conservate a -80 ℃ fino all'estrazione del DNA e ad altri test. Vengono elaborati i test che includono il contenuto di acidi grassi a catena corta (SCFA), il pH, il contenuto di acqua, i fattori immunitari sIgA e la calprotectina.

Sequenziamento del gene 16S rRNA dei batteri nelle feci:

Estrazione del DNA:

Per ogni campione, vengono pesati circa 0,2 g di feci e il DNA totale viene estratto utilizzando il kit di estrazione del DNA genomico fecale (Qiagen, modello DP328). E poi la concentrazione e la purezza del DNA estratto sono state misurate utilizzando NanoDrop (Thermo, 2000C) per garantire che ogni campione soddisfi i requisiti di sequenziamento.

Sequenziamento del campione:

L'amplificazione PCR del gene 16S rRNA (V3-V4) viene eseguita con primer forward universali 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' e primer reverse 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. Il sistema di amplificazione include acqua sterile 19,375 ul, tampone 2,5 ul, template 1 ul, primer 1 ul, Pyrobest DNA polimerasi 0,125 ul. Le condizioni cicliche della PCR erano le seguenti: 94 ℃ 5 minuti, seguiti da alcuni cicli tra cui denaturazione a 94 ℃ per 30 secondi, rinaturazione a 50 ℃ per 30 secondi, estensione a 72 ℃ per 30 secondi, quindi estensione a 72 ℃ per 5 minuti. L'elettroforesi del prodotto PCR viene eseguita per determinare il prodotto PCR appropriato con diversi cicli di applicazione. Dopo aver collegato i prodotti amplificati a primer ed etichette etichettati, il sequenziamento paired-end viene eseguito con la piattaforma di sequenziamento di Illumina MiSeq e la lunghezza di lettura è di circa 250 bp.

Trattamento di intervento sull'obesità infantile con PFE:

Dopo il sequenziamento del gene 16S rRNA, circa 40 volontari obesi delle scuole superiori e con profili di flora intestinale simili vengono selezionati per partecipare alla ricerca sul trattamento dell'intervento. Il cibo che interviene è "Dr. Ephraim" estratto di fermentazione vegetale (PFE). Senza modificare le precedenti diete degli oggetti di ricerca, ogni oggetto di ricerca beve bevendo 30 ml di PFE rispettivamente al mattino e alla sera, e l'intervento dura 8 settimane. Prima e dopo l'intervento di 8 settimane, i campioni di feci e sangue degli oggetti di ricerca vengono raccolti e analizzati per ottenere i loro indici fisiologici e biochimici. Tutti i geni 16S rRNA dei campioni fecali in ciascuna fase vengono sequenziati.