Tutkimus ruokavalion ravitsemusinterventiotekniikoista lasten liikalihavuuden hoitoon

Ennen akateemista koetta koululaisille ja heidän huoltajilleen jaetaan kirje vanhemmille, tietoinen suostumus ja vapaaehtoiskysely. Kerromme vapaaehtoisille ja heidän huoltajilleen tästä tutkimuksesta ja kutsumme heidät osallistumaan tähän tutkimukseen. Vain vapaaehtoiset ja huoltajat allekirjoittavat vanhemmille osoitetussa kirjeessä ja tietoisen suostumuksen voivat tutkia tutkimuskohteita.

Kokeellinen menettely:

Koko kokeen tutkimusta varten tarvitaan kaksi kertaa lääkärintarkastus, veri- ja ulostenäytteenotto. Ensimmäiset kokeet ja näytteenotto suoritetaan akateemisen kokeen aikana; toinen kerta jatkuu toimenpiteen jälkeen.

Tutkimuskohteiden rekrytointi:

Akateemisten tutkimusten ja vapaaehtoisten kyselylomakkeiden mukaan rekrytoidaan noin 300 tervettä lasta, jotka eivät ole saaneet antibiootteja ennen 3 kuukauden ikää, ja heidän painoindeksinsä pitäisi olla liikalihavuuden rajoissa. Sitten mitataan heidän vyötärön ympärysmitta ja kehon rasvan suhde. Jos heidän vyötärön koon ja painon suhde on >0,46 ja rasvaprosentti on suurempi (pojilla ja alle 12-vuotiailla tytöillä >20%, 12-vuotiailla tytöillä >25%), tiedot kerätään ja syötetään. tietokantaan. Noin 40 tervettä 15-18-vuotiasta lasta rekrytoidaan osallistumaan seuraavaan interventiotutkimukseen.

Yleinen kehontarkastus:

Akateemisessa kokeessa opiskelijan lääketieteelliset perustiedot, mukaan lukien pituus ja paino, kirjataan, minkä jälkeen lasketaan hänen BMI. Jos hänen painoindeksinsä on liikalihavuuden alueella, hänen ruumiinkoostumus mitataan ja kirjataan.

MRI ja MRS testi:

Kaikille potilaille tehtiin MRI-skannaus, jonka suoritti kokenut teknikko käyttäen 3 Teslan MR-yksikköä (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Saksa). MRI ja MRS suoritettiin multi-echo Dixon- ja HISTO-sekvensseillä, vastaavasti maksan protonitiheysrasvafraktion (PDFF) laskemiseksi.

Verenotto, säilytys ja testi:

Verenotto ja säilöntä etenevät normaalin lääkärintarkastuksen mukaisesti. Lihavuustietoja kerättäessä tulee käsitellä lihavien lasten verenkuvan, verensokerin, seerumin lipidi- ja maksan toiminnan mittaukset. Kun väliin tulee, tulee käsitellä lisää testejä, mukaan lukien verenkuva, verensokeri, veren lipidit, maksan toiminta, hemoglobiini, sytokiinit, insuliini, korkean herkkyys C-reaktiivinen proteiini, leptiini ja somatomediini C.

Ulosteiden kerääminen, säilytys ja havaitseminen:

Ulostenäytteiden keräämiseen käytetään 50 ml:n sentrifugiputkia. Jokaiseen putkeen on merkitty yksilöllinen koodaus, joka vastaa vapaaehtoista. Kun vapaaehtoiset keräävät ulostenäytteitä, he siirtävät ulostenäytteet steriiliin sentrifugiputkeen steriileillä vanupuikoilla tai hammastikuilla mahdollisimman pian. Keräysnäytteiden tulee olla yli 10 g. Sentrifugiputket tulee laittaa matalan lämpötilan paikkaan, siirtää sitten jääkaappiin ja säilyttää -80 ℃:ssa DNA-uuttoon ja muihin testauksiin asti. Testit, jotka sisältävät lyhytketjuisten rasvahappojen pitoisuuden (SCFA), pH:n, vesipitoisuuden, immuunitekijät sIgA ja Calprotectin, käsitellään.

Bakteerien 16S rRNA -geenisekvensointi ulosteessa:

DNA:n erottaminen:

Kutakin näytettä kohti punnitaan noin 0,2 g ulostetta ja kokonais-DNA uutetaan käyttämällä ulosteen genomisen DNA:n uuttosarjaa (Qiagen, malli DP328). Ja sitten uutetun DNA:n pitoisuus ja puhtaus mitattiin NanoDropilla (Thermo, 2000C) sen varmistamiseksi, että jokainen näyte täyttää sekvensointivaatimukset.

Näytejärjestys:

16S-rRNA-geenin (V3-V4) PCR-monistaminen suoritetaan yleisillä eteenpäin suuntautuvilla alukkeilla 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' ja käänteisalukkeella 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. Monistusjärjestelmä sisältää steriiliä vettä 19,375 ul, puskuria 2,5 ul, templaattia 1 ul, alukkeita 1 ul, Pyrobest DNA -polymeraasia 0,125 ul. PCR-sykliolosuhteet olivat seuraavat: 94 ℃ 5 min, jota seurasi jotkin jaksot, mukaan lukien 94 ℃ denaturointi 30 s, 50 ℃ renaturointi 30 s, 72 ℃ jatkuu 30 s, sitten 72 ℃ jatketus 5 min. PCR-tuotteen elektroforeesi suoritetaan sopivan PCR-tuotteen määrittämiseksi eri käyttösykleillä. Kun monistetut tuotteet on liitetty merkittyihin alukkeisiin ja tarroihin, paripään sekvensointi suoritetaan Illumina MiSeqin sekvensointialustalla, ja lukupituus on noin 250 bp.

Lasten liikalihavuuden interventiohoito PFE:llä:

16S-rRNA-geenin sekvensoinnin jälkeen noin 40 ylipainoista vapaaehtoista, joilla on samanlainen suolistoflooraprofiili, valitaan osallistumaan interventiohoitotutkimukseen. Välissä oleva ruoka on "Dr. Ephraim" kasvikäymisuute (PFE). Muuttamatta aiempaa tutkimuskohteiden ruokavaliota, jokainen tutkimuskohde juo 30 ml PFE:tä aamu- ja iltaentsyymeillä, ja interventio kestää 8 viikkoa. Ennen ja jälkeen 8 viikon interventiota kerätään uloste- ja verinäytteitä tutkimuskohteista ja analysoidaan niiden fysiologisten ja biokemiallisten indeksien saamiseksi. Ulostenäytteiden kaikki 16S-rRNA-geeni kussakin vaiheessa sekvensoidaan.