Studie over voedingsinterventietechnieken voor kinderen met obesitas

Voorafgaand aan het academisch onderzoek worden de brief aan de ouders, de geïnformeerde toestemming en de vragenlijst voor vrijwilligers vrijgegeven aan schoolkinderen en hun voogden. We vertellen de vrijwilligers en hun verzorgers over dit onderzoek en nodigen hen uit om deel te nemen aan dit onderzoek. Alleen de handtekening van de vrijwilligers en voogden op de brief aan de ouders en geïnformeerde toestemming zijn in staat tot de onderzoeksobjecten.

Experimentele procedures:

Twee keer medische onderzoeken, bloed- en ontlastingsmonsters zijn vereist voor het hele experimentonderzoek. De eerste keer dat examens en het verzamelen van monsters worden uitgevoerd tijdens een academisch examen; de tweede keer vindt plaats na de ingreep.

Rekrutering van onderzoeksobjecten:

Volgens academisch onderzoek en vragenlijsten van vrijwilligers worden ongeveer 300 gezonde kinderen gerekruteerd die binnen 3 maanden geen antibiotica hebben ingenomen en hun BMI zou in het zwaarlijvige bereik moeten liggen. Vervolgens worden hun middelomtrek en de verhouding lichaamsvet gemeten. Als de verhouding tussen tailleomvang en gewicht >0,46 is en ze een hoger percentage lichaamsvet hebben (>20% voor jongens en meisjes onder de 12 jaar, >25% voor meisjes van 12 jaar), worden de gegevens verzameld en ingevoerd naar de databank. Ongeveer 40 gezonde kinderen tussen de 15 en 18 jaar worden geworven om deel te nemen aan het volgende interventieonderzoek.

Algemeen lichaamsonderzoek:

Bij academisch onderzoek worden de medische basisgegevens van de student, inclusief lengte en gewicht, geregistreerd en vervolgens wordt hun BMI berekend. Als zijn/haar BMI in het zwaarlijvige bereik ligt, wordt zijn/haar lichaamssamenstelling gemeten en geregistreerd.

MRI- en MRS-test:

Alle patiënten ondergingen een MRI-scan uitgevoerd door een ervaren technoloog met behulp van een 3 Tesla MR-eenheid (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Duitsland). MRI en MRS werden uitgevoerd met respectievelijk multi-echo Dixon- en HISTO-sequenties om de hepatische protonendichtheid-vetfractie (PDFF) te berekenen.

Bloedafname, conservering en test:

Bloedafname en -bewaring vinden plaats in de standaard van medisch onderzoek. Bij het verzamelen van de gegevens over obesitas, moeten de tests van het bloedbeeld, de bloedglucose, de serumlipiden en de leverfunctie worden verwerkt voor zwaarlijvige kinderen. Bij tussenkomst moeten meer tests worden uitgevoerd, waaronder bloedbeeld, bloedglucose, bloedlipiden, leverfunctie, hemoglobine, cytokines, insuline, hooggevoelig C-reactief proteïne, leptine en somatomedine C.

Ontlasting verzamelen, bewaren en detecteren:

Centrifugebuisjes van 50 ml worden gebruikt om ontlastingsmonsters te verzamelen. Elke buis is gemarkeerd met een unieke codering die overeenkomt met een vrijwilliger. Wanneer vrijwilligers ontlastingsmonsters verzamelen, brengen ze de ontlastingsmonsters zo snel mogelijk over in een steriele centrifugebuis met behulp van steriele wattenstaafjes of tandenstokers. De verzamelmonsters moeten meer dan 10 g zijn. De centrifugebuizen moeten op een plaats met lage temperatuur worden geplaatst, vervolgens in de koelkast worden geplaatst en bij -80 ℃ worden bewaard tot DNA-extractie en andere tests. De tests worden onder meer gehalte aan korte keten vetzuren (SCFA), pH, watergehalte, immuunfactoren sIgA en Calprotectin verwerkt.

16S rRNA-gensequentiebepaling van bacteriën in ontlasting:

DNA-extractie:

Voor elk monster wordt ongeveer 0,2 g ontlasting gewogen en het totale DNA wordt geëxtraheerd met behulp van fecale genomische DNA-extractiekit (Qiagen, model DP328). En vervolgens werden de concentratie en zuiverheid van geëxtraheerd DNA gemeten met behulp van NanoDrop (Thermo, 2000C) om te garanderen dat elk monster voldoet aan de sequentiëringsvereiste.

Monstervolgorde:

PCR-amplificatie van het 16S-rRNA-gen (V3-V4) wordt uitgevoerd met universele voorwaartse primers 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' en omgekeerde primer 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. Het amplificatiesysteem omvat steriel water 19,375 µl, buffer 2,5 µl, template 1 µl, primers 1 µl, Pyrobest DNA-polymerase 0,125 µl. De PCR-cyclusomstandigheden waren als volgt: 94 °C 5 min, gevolgd door enkele cycli waaronder 94 °C denaturatie gedurende 30 seconden, 50 °C renaturatie gedurende 30 seconden, 72 °C verlenging gedurende 30 seconden, daarna 72 °C verlenging gedurende 5 minuten. PCR-productelektroforese wordt uitgevoerd om het juiste PCR-product te bepalen met verschillende toepassingscycli. Na het verbinden van geamplificeerde producten met gelabelde primers en labels, wordt paired-end sequencing uitgevoerd met het sequencing-platform van Illumina MiSeq, en de leeslengte is ongeveer 250 bp.

Interventiebehandeling bij obesitas bij kinderen met PFE:

Na 16S rRNA-gensequencing worden ongeveer 40 zwaarlijvige vrijwilligers op de middelbare school en met vergelijkbare darmfloraprofielen geselecteerd om deel te nemen aan het interventiebehandelingsonderzoek. Het tussenliggende voedsel is "Dr. Ephraim" plantenfermentatie-extract (PFE). Zonder de eerdere voeding van onderzoeksobjecten te veranderen, drinkt elk onderzoeksobject 30 ml PFE bij respectievelijk ochtend- en avondenzymen, en de interventie duurt 8 weken. Voor en na een interventie van 8 weken worden ontlastings- en bloedmonsters van onderzoeksobjecten verzameld en geanalyseerd om hun fysiologische en biochemische indexen te verkrijgen. Van het volledige 16S rRNA-gen van fecale monsters in elke fase wordt de sequentie bepaald.