Estudio sobre Técnicas de Intervención Dietética Nutricional para la Obesidad Infantil

Antes del examen académico, se entrega a los escolares y sus tutores una carta a los padres, un consentimiento informado y un cuestionario para voluntarios. Les decimos a los voluntarios y sus tutores qué pasa con este estudio y los invitamos a participar en este estudio. Sólo la firma de los voluntarios y tutores en la carta a los padres y el consentimiento informado son capaces de los objetos de investigación.

Procedimientos experimentales:

Se requieren dos veces de exámenes médicos, recolección de muestras de sangre y heces para toda la investigación del experimento. La primera vez que los exámenes y la recolección de muestras se llevan a cabo durante el examen académico; la segunda vez se lleva a cabo después de la intervención.

Reclutamiento de objetos de investigación:

De acuerdo con el examen académico y los cuestionarios de voluntarios, se reclutan alrededor de 300 niños sanos que no toman antibióticos antes de los 3 meses y su IMC debería estar en el rango de obesidad. Luego se mide la circunferencia de su cintura y la proporción de grasa corporal. Si la relación entre el tamaño de la cintura y el peso de ellos es > 0,46 y tienen un mayor porcentaje de grasa corporal (> 20 % para niños y niñas menores de 12 años, > 25 % para niñas de 12 años), los datos se recopilan y se ingresan. a la base de datos. Se reclutan alrededor de 40 niños sanos de entre 15 y 18 años para participar en la próxima investigación de intervención.

Examen corporal general:

En el examen académico, se registran los datos médicos básicos del estudiante, incluidos la altura y el peso, y luego se calcula su IMC. Si su IMC está en el rango de obesidad, se mide y registra su composición corporal.

Prueba de MRI y MRS:

Todos los pacientes se sometieron a una resonancia magnética realizada por un tecnólogo experimentado utilizando una unidad de RM de 3 Tesla (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Alemania). Se realizaron MRI y MRS con secuencias multieco Dixon e HISTO, respectivamente, para calcular la fracción de grasa de densidad protónica hepática (PDFF).

Extracción de sangre, conservación y análisis:

La recolección y conservación de sangre se realiza de acuerdo con el estándar del examen médico. Al recolectar los datos de obesidad, se deben procesar las pruebas de hemograma, glucosa en sangre, lípidos séricos y función hepática para niños obesos. Al intervenir se deben procesar más exámenes como hemograma, glucemia, lípidos en sangre, función hepática, hemoglobina, citocinas, insulina, proteína C reactiva de alta sensibilidad, leptina y somatomedina C.

Recolección, preservación y detección de heces:

Se utilizan tubos de centrífuga de 50 ml para recoger muestras de heces. Cada tubo está marcado con una codificación única que corresponde a un voluntario. Cuando los voluntarios recolectan muestras de heces, las transfieren a un tubo de centrífuga estéril utilizando hisopos o palillos de dientes estériles lo antes posible. Las muestras de recolección deben tener más de 10 g. Los tubos de centrífuga deben colocarse en un lugar de baja temperatura, luego transferirse al refrigerador y almacenarse a -80 ℃ hasta la extracción de ADN y otras pruebas. Se procesan las pruebas que incluyen contenido de ácidos grasos de cadena corta (SCFA), pH, contenido de agua, factores inmunes sIgA y Calprotectina.

Secuenciación del gen 16S rRNA de bacterias en heces:

Extracción de ADN:

Para cada muestra, se pesan aproximadamente 0,2 g de heces y se extrae el ADN total utilizando el kit de extracción de ADN genómico fecal (Qiagen, modelo DP328). Y luego, la concentración y la pureza del ADN extraído se midieron con NanoDrop (Thermo, 2000C) para garantizar que cada muestra cumpla con el requisito de secuenciación.

Muestra de secuenciación:

La amplificación por PCR del gen 16S rRNA (V3-V4) se realiza con los cebadores directos universales 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' y el cebador inverso 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. El sistema de amplificación incluye 19.375 ul de agua esterilizada, 2.5 ul de tampón, 1 ul de plantilla, 1 ul de cebadores, 0.125 ul de Pyrobest DNA polimerasa. Las condiciones del ciclo de PCR fueron las siguientes: 94 ℃ 5 min, seguido de algunos ciclos que incluyen 94 ℃ de desnaturalización durante 30 s, 50 ℃ de renaturalización durante 30 s, 72 ℃ de extensión durante 30 s, luego 72 ℃ de extensión durante 5 min. La electroforesis del producto de PCR se realiza para determinar el producto de PCR apropiado con diferentes ciclos de aplicación. Después de conectar los productos amplificados a los cebadores y etiquetas etiquetados, la secuenciación de extremos emparejados se realiza con la plataforma de secuenciación de Illumina MiSeq y la longitud de lectura es de aproximadamente 250 pb.

Tratamiento de intervención sobre la obesidad infantil con PFE:

Después de la secuenciación del gen 16S rRNA, se seleccionan alrededor de 40 voluntarios obesos en la escuela secundaria y con perfiles de flora intestinal similares para participar en la investigación del tratamiento de intervención. El alimento intermedio es "Dr. Extracto de fermentación vegetal (PFE) de Ephraim". Sin cambiar las dietas anteriores de los objetos de investigación, cada objeto de investigación bebe 30mL de PFE por la mañana y por la noche de enzimas respectivamente, y la intervención dura 8 semanas. Antes y después de la intervención de 8 semanas, se recolectan y analizan muestras de heces y sangre de los objetos de investigación para obtener sus índices fisiológicos y bioquímicos. Se secuencian todos los genes 16S rRNA de muestras fecales en cada etapa.