Badanie dotyczące dietetycznych technik interwencji żywieniowej u dzieci z otyłością

Przed egzaminem akademickim dzieciom w wieku szkolnym i ich opiekunom wydawane jest pismo do rodziców, świadoma zgoda i ankieta wolontariusza. Mówimy ochotnikom i ich opiekunom, co z tym badaniem i zapraszamy ich do udziału w tym badaniu. Tylko chętni i opiekunowie podpisują się pod listem do rodziców i wyrażają świadomą zgodę na badania obiektów.

Eksperymentalne procedury:

Do całego eksperymentu wymagane są dwukrotne badania lekarskie, pobranie próbek krwi i kału. Pierwsze egzaminy i pobieranie próbek przeprowadza się podczas egzaminu akademickiego; drugi raz odbywa się po interwencji.

Rekrutacja obiektów badawczych:

Według badań akademickich i kwestionariuszy ochotników rekrutuje się około 300 zdrowych dzieci nieprzyjmujących antybiotyków przed ukończeniem 3 miesiąca życia, których BMI powinno mieścić się w przedziale otyłości. Następnie mierzony jest ich obwód talii oraz stosunek tkanki tłuszczowej. Jeśli stosunek obwodu talii do masy ciała wynosi >0,46 i mają wyższy procent tkanki tłuszczowej (>20% dla chłopców i dziewcząt poniżej 12 lat, >25% dla dziewcząt w wieku 12 lat), dane są zbierane i wprowadzane do bazy danych. Do kolejnego badania interwencyjnego rekrutuje się około 40 zdrowych dzieci w wieku 15-18 lat.

Ogólne badanie ciała:

Podczas egzaminu akademickiego rejestrowane są podstawowe dane medyczne studenta, w tym wzrost i waga, a następnie obliczany jest jego wskaźnik BMI. Jeśli jego BMI mieści się w zakresie otyłości, mierzy się i rejestruje skład jego ciała.

Badanie MRI i MRS:

U wszystkich pacjentów wykonano badanie MRI wykonane przez doświadczonego technologa przy użyciu aparatu MR o mocy 3 tesli (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Niemcy). MRI i MRS przeprowadzono odpowiednio z wieloechowymi sekwencjami Dixona i HISTO, aby obliczyć frakcję tłuszczową o gęstości protonów w wątrobie (PDFF).

Pobieranie, przechowywanie i testowanie krwi:

Pobieranie i przechowywanie krwi odbywa się zgodnie ze standardem badania lekarskiego. Podczas zbierania danych dotyczących otyłości należy wykonać badania morfologii krwi, stężenia glukozy we krwi, lipidów w surowicy i czynności wątroby u otyłych dzieci. Podczas interwencji należy wykonać więcej badań, w tym morfologię krwi, stężenie glukozy we krwi, lipidy we krwi, czynność wątroby, hemoglobinę, cytokiny, insulinę, białko C-reaktywne o wysokiej czułości, leptynę i somatomedynę C.

Pobieranie, przechowywanie i wykrywanie kału:

Do pobierania próbek kału stosuje się probówki wirówkowe o pojemności 50 ml. Każda probówka jest oznaczona unikalnym kodowaniem odpowiadającym ochotnikowi. Gdy ochotnicy pobierają próbki kału, jak najszybciej przenoszą próbki kału do sterylnej probówki wirówkowej za pomocą sterylnych wacików lub wykałaczek. Pobierane próbki powinny ważyć więcej niż 10g. Probówki wirówkowe należy umieścić w miejscu o niskiej temperaturze, a następnie przenieść do lodówki i przechowywać w temperaturze -80 ℃ do czasu ekstrakcji DNA i innych testów. Przetwarzane są testy obejmujące zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), pH, zawartość wody, czynniki odpornościowe sIgA i kalprotektynę.

Sekwencjonowanie genu 16S rRNA bakterii w kale:

Ekstrakcja DNA:

Dla każdej próbki waży się około 0,2 g kału i ekstrahuje się całkowity DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA w kale (Qiagen, model DP328). Następnie zmierzono stężenie i czystość wyekstrahowanego DNA za pomocą NanoDrop (Thermo, 2000C), aby zagwarantować, że każda próbka spełnia wymagania dotyczące sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie próbek:

Amplifikację PCR genu 16S rRNA (V3-V4) przeprowadza się z uniwersalnymi starterami do przodu 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' i starterem do tyłu 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. System do amplifikacji zawiera sterylną wodę 19,375 ul, bufor 2,5 ul, matrycę 1 ul, startery 1 ul, polimerazę DNA Pyrobest 0,125 ul. Warunki cyklu PCR były następujące: 94 ℃ 5 min, a następnie kilka cykli, w tym 94 ℃ denaturacja przez 30 s, 50 ℃ renaturacja przez 30 s, 72 ℃ wydłużanie przez 30 s, następnie 72 ℃ wydłużanie przez 5 min. Przeprowadza się elektroforezę produktu PCR w celu określenia odpowiedniego produktu PCR przy różnych cyklach stosowania. Po połączeniu amplifikowanych produktów ze znakowanymi starterami i znacznikami przeprowadza się sekwencjonowanie sparowanych końców za pomocą platformy sekwencjonowania Illumina MiSeq, a długość odczytu wynosi około 250 pz.

Leczenie interwencyjne otyłości u dzieci za pomocą PFE:

Po zsekwencjonowaniu genu 16S rRNA, około 40 otyłych ochotników ze szkół średnich io podobnych profilach flory jelitowej zostaje wybranych do udziału w badaniach dotyczących leczenia interwencyjnego. Interweniujące jedzenie to „Dr. Ephraim” roślinny ekstrakt fermentacyjny (PFE). Bez zmiany dotychczasowych diet obiektów badawczych, każdy obiekt badawczy pije odpowiednio rano i wieczorem po 30ml PFE enzymów, a interwencja trwa 8 tygodni. Przed i po 8-tygodniowej interwencji pobiera się i analizuje próbki kału i krwi obiektów badawczych w celu uzyskania ich wskaźników fizjologicznych i biochemicznych. Wszystkie geny 16S rRNA z próbek kału na każdym etapie są sekwencjonowane.