Studie über diätetische Ernährungsinterventionstechniken bei Fettleibigkeit bei Kindern

Vor der akademischen Prüfung werden den Schulkindern und ihren Erziehungsberechtigten ein Brief an die Eltern, eine Einverständniserklärung und ein Freiwilligenfragebogen ausgehändigt. Wir erzählen den Freiwilligen und ihren Erziehungsberechtigten, was es mit dieser Studie auf sich hat, und laden sie ein, an dieser Studie teilzunehmen. Nur die Freiwilligen und Erziehungsberechtigten dürfen mit ihrer Unterschrift auf dem Brief an die Eltern und ihrer Einverständniserklärung an den Forschungsobjekten teilnehmen.

Experimentelle Verfahren:

Für die gesamte experimentelle Forschung sind zwei ärztliche Untersuchungen sowie die Entnahme von Blut- und Stuhlproben erforderlich. Die ersten Prüfungen und Probenentnahmen finden im Rahmen der akademischen Prüfung statt; das zweite Mal erfolgt nach dem Eingriff.

Rekrutierung von Forschungsobjekten:

Laut akademischer Untersuchung und Freiwilligenfragebögen werden etwa 300 gesunde Kinder rekrutiert, die vor dem dritten Monat keine Antibiotika eingenommen haben und deren BMI im adipösen Bereich liegen sollte. Anschließend werden ihr Taillenumfang und der Körperfettanteil gemessen. Wenn das Verhältnis von Taillenumfang zu Gewicht >0,46 beträgt und sie einen höheren Körperfettanteil haben (>20 % für Jungen und unter 12-jährige Mädchen, >25 % für 12-jährige Mädchen), werden die Daten erfasst und eingegeben zur Datenbank. Etwa 40 gesunde Kinder im Alter zwischen 15 und 18 Jahren werden für die Teilnahme an der nächsten Interventionsforschung rekrutiert.

Allgemeine Körperuntersuchung:

Bei der akademischen Untersuchung werden die grundlegenden medizinischen Daten des Studenten, einschließlich Größe und Gewicht, erfasst und anschließend sein BMI berechnet. Wenn sein/ihr BMI im Fettleibigkeitsbereich liegt, wird seine/ihre Körperzusammensetzung gemessen und aufgezeichnet.

MRT- und MRS-Test:

Alle Patienten wurden einer MRT-Untersuchung unterzogen, die von einem erfahrenen Techniker mit einem 3-Tesla-MR-Gerät (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland) durchgeführt wurde. MRT und MRS wurden mit Multi-Echo-Dixon- bzw. HISTO-Sequenzen durchgeführt, um die hepatische Protonendichte-Fettfraktion (PDFF) zu berechnen.

Blutentnahme, -konservierung und -untersuchung:

Die Blutentnahme und -konservierung erfolgt im Rahmen einer ärztlichen Untersuchung. Bei der Erhebung der Daten zur Adipositas sollten bei adipösen Kindern auch Blutbild-, Blutzucker-, Serumlipid- und Leberfunktionstests berücksichtigt werden. Bei der Intervention sollten weitere Tests durchgeführt werden, darunter Blutbild, Blutzucker, Blutfette, Leberfunktion, Hämoglobin, Zytokine, Insulin, hochempfindliches C-reaktives Protein, Leptin und Somatomedin C.

Stuhlsammlung, -konservierung und -nachweis:

Zur Sammlung von Stuhlproben werden 50-ml-Zentrifugenröhrchen verwendet. Jede Röhre ist mit einer eindeutigen Codierung gekennzeichnet, die einem Freiwilligen entspricht. Wenn Freiwillige Stuhlproben entnehmen, überführen sie die Stuhlproben so schnell wie möglich mit sterilen Tupfern oder Zahnstochern in sterile Zentrifugenröhrchen. Die Sammelproben sollten mehr als 10g betragen. Die Zentrifugenröhrchen sollten an einen Ort mit niedriger Temperatur gestellt, dann in den Kühlschrank gestellt und bis zur DNA-Extraktion und anderen Tests bei -80 °C gelagert werden. Die Tests umfassen den Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren (SCFA), den pH-Wert, den Wassergehalt, die Immunfaktoren sIgA und Calprotectin.

16S-rRNA-Gensequenzierung von Bakterien im Stuhl:

DNA-Extraktion:

Für jede Probe werden etwa 0,2 g Stuhl abgewogen und die Gesamt-DNA wird mit dem fäkalen genomischen DNA-Extraktionskit (Qiagen, Modell DP328) extrahiert. Anschließend wurden die Konzentration und Reinheit der extrahierten DNA mit NanoDrop (Thermo, 2000 °C) gemessen, um sicherzustellen, dass jede Probe die Sequenzierungsanforderungen erfüllt.

Probensequenzierung:

Die PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens (V3-V4) wird mit den universellen Vorwärtsprimern 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' und dem Rückwärtsprimer 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3' durchgeführt. Das Amplifikationssystem umfasst 19,375 µl steriles Wasser, 2,5 µl Puffer, 1 µl Matrize, 1 µl Primer und 0,125 µl Pyrobest-DNA-Polymerase. Die PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: 94 °C 5 Minuten, gefolgt von einigen Zyklen, einschließlich 94 °C Denaturierung für 30 Sekunden, 50 °C Renaturierung für 30 Sekunden, 72 °C Verlängerung für 30 Sekunden, dann 72 °C Verlängerung für 5 Minuten. Um das geeignete PCR-Produkt mit unterschiedlichen Anwendungszyklen zu bestimmen, wird eine PCR-Produktelektrophorese durchgeführt. Nach der Verbindung der amplifizierten Produkte mit markierten Primern und Markierungen wird die Paired-End-Sequenzierung mit der Sequenzierungsplattform von Illumina MiSeq durchgeführt. Die Leselänge beträgt etwa 250 bp.

Interventionsbehandlung bei Fettleibigkeit bei Kindern mit PFE:

Nach der 16S-rRNA-Gensequenzierung werden etwa 40 adipöse Freiwillige in der Oberstufe und mit ähnlichen Darmfloraprofilen ausgewählt, um an der Interventionsbehandlungsforschung teilzunehmen. Das dazwischenliegende Essen ist „Dr. Ephraim-Pflanzenfermentationsextrakt (PFE). Ohne die bisherige Ernährung der Forschungsobjekte zu ändern, trinkt jedes Forschungsobjekt 30 ml PFE zu den Enzymen am Morgen bzw. am Abend und die Intervention dauert 8 Wochen. Vor und nach der 8-wöchigen Intervention werden Stuhl- und Blutproben von Forschungsobjekten gesammelt und analysiert, um deren physiologische und biochemische Indizes zu ermitteln. Das gesamte 16S-rRNA-Gen der Stuhlproben in jedem Stadium wird sequenziert.