Estudo sobre Técnicas de Intervenção em Nutrição Alimentar na Obesidade Infantil

Antes do exame acadêmico, carta aos pais, consentimento informado e questionário voluntário são liberados para as crianças em idade escolar e seus responsáveis. Contamos aos voluntários e seus responsáveis ​​sobre este estudo e os convidamos a participar deste estudo. Somente a assinatura dos voluntários e responsáveis ​​na carta aos pais e o consentimento informado estão aptos aos objetos da pesquisa.

Procedimentos experimentais:

Duas vezes de exames médicos, coleta de amostras de sangue e fezes são necessárias para toda a pesquisa do experimento. A primeira vez que os exames e coleta de amostras são realizados durante o exame acadêmico; a segunda vez é realizada após a intervenção.

Recrutamento de objetos de pesquisa:

De acordo com exames acadêmicos e questionários voluntários, cerca de 300 crianças saudáveis ​​sem tomar antibióticos antes de 3 meses são recrutadas e seu IMC deve estar na faixa de obesidade. Em seguida, a circunferência da cintura e a proporção de gordura corporal são medidas. Se a relação entre o tamanho da cintura e o peso deles for > 0,46 e eles tiverem maior percentual de gordura corporal (> 20% para meninos e meninas menores de 12 anos, > 25% para meninas de 12 anos), os dados são coletados e inseridos ao banco de dados. Cerca de 40 crianças saudáveis ​​entre 15-18 anos são recrutadas para participar da próxima pesquisa de intervenção.

Exame geral do corpo:

No exame acadêmico, os dados médicos básicos do aluno, incluindo altura e peso, são registrados e, em seguida, seu IMC é calculado. Se seu IMC estiver na faixa de obesidade, sua composição corporal será medida e registrada.

Exame de ressonância magnética e ressonância magnética:

Todos os pacientes foram submetidos a ressonância magnética realizada por um tecnólogo experiente usando uma unidade de ressonância magnética de 3 Tesla (MAGNETOM Skyra, Siemens Healthcare, Erlangen, Alemanha). MRI e MRS foram realizadas com sequências Dixon e HISTO multi-eco, respectivamente, para calcular a fração de gordura da densidade protônica hepática (PDFF).

Coleta, preservação e teste de sangue:

A coleta e a preservação do sangue são realizadas de acordo com o padrão do exame médico. Ao coletar os dados da obesidade, devem ser processados ​​os exames de hemograma, glicemia, lipídios séricos e função hepática para crianças obesas. Ao intervir, mais testes, incluindo hemograma, glicemia, lipídios no sangue, função hepática, hemoglobina, citocinas, insulina, proteína C reativa de alta sensibilidade, leptina e somatomedina C devem ser processados.

Coleta, preservação e detecção de fezes:

Tubos de centrífuga de 50 ml são usados ​​para coletar amostras de fezes. Cada tubo é marcado com uma codificação única que corresponde a um voluntário. Quando os voluntários coletam amostras de fezes, eles transferem as amostras de fezes para um tubo de centrífuga estéril usando cotonetes estéreis ou palitos de dente o mais rápido possível. As amostras coletadas devem ter mais de 10g. Os tubos da centrífuga devem ser colocados em local de baixa temperatura, depois transferidos para a geladeira e armazenados a -80 ℃ até a extração do DNA e outros testes. Os testes, incluindo teor de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), pH, teor de água, fatores imunológicos sIgA e Calprotectina são processados.

Sequenciamento do gene 16S rRNA de bactérias nas fezes:

Extração de DNA:

Para cada amostra, cerca de 0,2 g de fezes são pesados ​​e o DNA total é extraído usando o kit de extração de DNA genômico fecal (Qiagen, modelo DP328). E então a concentração e a pureza do DNA extraído foram medidas usando NanoDrop (Thermo, 2000C) para garantir que cada amostra atenda aos requisitos de sequenciamento.

Sequenciamento de amostras:

A amplificação por PCR do gene 16S rRNA (V3-V4) é realizada com primers diretos universais 5'-ACTCCTACGGGGAGGCAGCAG-3' e primer reverso 5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'. O sistema de amplificação inclui água estéril 19,375 ul, tampão 2,5 ul, modelo 1 ul, primers 1 ul, Pyrobest DNA polimerase 0,125 ul. As condições dos ciclos de PCR foram as seguintes: 94 ℃ 5min, seguido por alguns ciclos, incluindo 94 ℃ desnaturação por 30s, 50 ℃ renaturação por 30s, 72 ℃ estendendo-se por 30s, depois 72 ℃ estendendo-se por 5min. A eletroforese do produto de PCR é realizada para determinar o produto de PCR apropriado com diferentes ciclos de aplicação. Depois de conectar produtos amplificados a primers e rótulos marcados, o sequenciamento paired-end é realizado com a plataforma de sequenciamento do Illumina MiSeq, e o comprimento de leitura é de cerca de 250bp.

Tratamento de intervenção na obesidade infantil com PFE:

Após o sequenciamento do gene 16S rRNA, cerca de 40 voluntários obesos no ensino médio e com perfis de flora intestinal semelhantes são selecionados para participar da pesquisa de tratamento de intervenção. A comida intermediária é "Dr. Ephraim" extrato de fermentação vegetal (PFE). Sem alterar as dietas anteriores dos objetos de pesquisa, cada objeto de pesquisa bebe 30mL de PFE nas enzimas da manhã e da noite, respectivamente, e a intervenção dura 8 semanas. Antes e após a intervenção de 8 semanas, amostras de fezes e sangue dos objetos de pesquisa são coletadas e analisadas para obter seus índices fisiológicos e bioquímicos. Todos os genes 16S rRNA das amostras fecais em cada estágio são sequenciados.