妊娠中の運動が母体と胎児の健康に及ぼす影響 (GESTAFIT)

実験的：ジェスタフィトス

これは、GESTAtion and FITness (GESTAFIT) プロジェクトの継続として開発された縦断研究です。 主な目的は、妊娠中の同時的運動プログラム（GESTAFITプロジェクトで開発されたもの）が、4歳時点での子孫の体組成、身体的フィットネス、脳構造、および運動、認知、言語発達に及ぼす影響を評価することです。

他の：運動介入

運動介入は1グループ12～13名となるように2グループに分けて行い、妊娠16週目から出産まで週3日（1回60分）トレーニングを行います。 運動介入グループは、トレーニングのさまざまな段階を経ます。 a) 学習段階: 介入計画、取り組みたい目標、およびそれを実行する方法が含まれます。 b) 動作学習フェーズ: 動作と人間工学的基本パターンの説明による理論的および実践的なセッション。 c) 体力トレーニング段階: フィットネスの向上と減量を目的としたトレーニング セッションと、出産に向けた正しい骨盤の可動性に焦点を当てたトレーニング セッションを行います。強度は、妊娠週数と各妊婦に基づいて運動プログラム中に調整されます。心拍数。 セッションは、筋肉と心臓血管の両方のコンディショニングが実施されるサーキットで構成される混合ワークで構成されます。

他の：対照群

通常のケア、運動なし。

実験的：胎盤トレーニング

これは、GESTAFITプロジェクトに参加した女性の胎盤の状態を分析することを目的とした後ろ向き研究です。GESTAFITプロジェクトでは、同時進行の運動プログラムが実施されました。 この厳密な研究デザインにより、妊娠中の運動が妊娠合併症に関連する胎盤代謝経路の改善をより大きくもたらし、より良い妊娠および新生児転帰と関連するという中心仮説を検証することが可能になります。

他の：運動介入

運動介入は1グループ12～13名となるように2グループに分けて行い、妊娠16週目から出産まで週3日（1回60分）トレーニングを行います。 運動介入グループは、トレーニングのさまざまな段階を経ます。 a) 学習段階: 介入計画、取り組みたい目標、およびそれを実行する方法が含まれます。 b) 動作学習フェーズ: 動作と人間工学的基本パターンの説明による理論的および実践的なセッション。 c) 体力トレーニング段階: フィットネスの向上と減量を目的としたトレーニング セッションと、出産に向けた正しい骨盤の可動性に焦点を当てたトレーニング セッションを行います。強度は、妊娠週数と各妊婦に基づいて運動プログラム中に調整されます。心拍数。 セッションは、筋肉と心臓血管の両方のコンディショニングが実施されるサーキットで構成される混合ワークで構成されます。

他の：対照群

通常のケア、運動なし。

インスリン抵抗性の恒常性モデル評価から導出されたインスリン感受性 (HOMA-IR)

インスリン感受性は、インスリン抵抗性の恒常性モデル評価 (HOMA-IR) から導出され、式 [空腹時インスリン (μIU/mL) x 空腹時血糖 (mg/dL)]/405 を使用して計算されます。

母体の体重増加 (kg)

母体の体重増加は、ベースライン測定から最後の測定ま​​での体重変化として定義されます。

新生児のインスリングルコース指数

新生児のインスリン感受性は、グルコース/インスリンの比によって評価されます。

収縮期血圧と拡張期血圧 (mmHg)

収縮期血圧と拡張期血圧（mmHg）は、5 分間の安静の後、座った状態で 2 回（試行間に 2 分間隔で）測定されます（Omron Health Care Europe B.V. Hoolddorp）。 2 つの試行の最小値が分析用に選択されます。

安静時の心拍数 (bpm)

安静時心拍数 (bpm) は、5 分間の休息後、座った状態で 2 回 (試行間隔は 2 分) 測定されます (Omron Health Care Europe B.V. Hoolddorp)。 2 つの試行の最小値が分析用に選択されます。

地中海ダイエットのスコア

鉄、カルシウム、葉酸の妊娠中の特定のニーズに適応したバージョンの地中海ダイエットスコアは、伝統的な地中海食パターンの順守を評価するために使用されます。

心肺機能のフィットネス (Vo2max)

修正ブルース プロトコルは、最大酸素摂取量 (VO2max) を推定するために実行され、心肺機能の指標として使用されます。

心肺機能のフィットネス (6 分間の歩行テストでのメートル数)

6 分間歩行テストを実行し、各参加者が 45.7 m の長方形のコースに沿って 6 分間に歩行できる最大距離 (メートル単位) を測定します。

筋力(kg)

握力テストは強さの尺度として使用されます

柔軟性 (cm)

バックスクラッチテストは柔軟性の尺度として使用されます

身体活動と座りっぱなしの行動（分単位）

加速度測定は、身体活動と座りっぱなしの時間を客観的に評価するために使用されます。 女性は、モニターを受け取った同じ日から連続して 9 日間、三軸加速度計 (ActiSleep+、フロリダ州ペンサコーラ) を装着するように求められます (例: 月曜日に加速度計を受け取った参加者は、翌週の火曜日までデバイスを持ち歩きます）。 参加者は、弾性ベルトで手首に加速度計を一日 (24 時間) 装着するように指示されます。 軽度、中度、中度以上の強度の PA を行った時間 (分単位) と座りっぱなしの時間が計算されます。 この加速度計は、本プロトコルで説明されているのと同様の方法論で妊娠中に以前に使用されています。

睡眠行動 (加速度測定による)

入眠、入眠潜時、総睡眠時間、覚醒の回数と継続時間、睡眠効率などの睡眠に関連する行動は、三軸加速度計 (ActiSleep+、米国フロリダ州ペンサコーラ) を使用して客観的に計算されます。 このような ActiSleep 加速度計データのデータ分析は、専用ソフトウェア (Actilife) を通じて実行されます。

ピッツバーグ睡眠の質指数

これは、1 か月の間隔で睡眠の質と睡眠障害を評価するために使用されます。

不眠症の症状に関するアンケート

不眠症の症状の有無は、妊婦で検証された不眠症症状アンケートで測定されます。

生活の質 (簡易健康調査 36)

健康関連の生活の質を評価するために、簡易健康調査 36 を使用します。

疫学調査 - うつ病スケール質問票

妊娠中の出生前うつ病レベルは、妊娠中に検証され広く採用されている疫学研究センターのうつ病スケール質問票によって評価されます。

状態特性不安指数。

不安レベルは州特性不安指数で評価されます。

レストレスレッグス症候群の拘留に関するアンケート

「レストレスレッグス症候群」は、多くの妊娠中の生活の質を大きく左右し、うつ病のレベルと睡眠の質に関連しています。 この症候群の存在と重症度を評価するために、スペイン語版の拘禁レストレスレッグス症候群アンケートが使用されます。

オスウェストリー障害指数スコア

腰痛はスペイン語版のオスウェストリー障害指数スコアで評価されます

痛みの視覚的アナログスケール

腰痛の強度もPain Visual Analogue Scaleで評価されます。

6項目の女性性機能指数

性機能を評価するには、6項目の女性性機能指数が使用されます。 この手段は、欲望、覚醒、潤滑、オーガズム、満足、痛みの 6 つの質問で構成されています。 各質問には 0 から 5 のスコアが付けられ、合計して合計スコアが得られます。

ポジティブな健康

「ポジティブな健康状態」は以下のアンケートを通じて評価されます。

1. 特性メタムードスケール
2. ポジティブな影響とネガティブな影響のスケジュール
3. ライフスケールの満足度
4. 10 項目の Connor-Davidson レジリエンス スケール

血液学

赤血球数、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板、白血球および赤血球の平均血球体積は、Coulter (Brand) によって定量化されます。

脂質プロファイル（母親および臍帯血中）

血漿総コレステロール、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、およびトリグリセリド (すべて mg/dL) は、自動分析装置 (Hitachi-Roche p800、F. Hoffmann-La Roche Ltd.) を使用して評価されます。 スイス）

血糖プロファイル（母親および臍帯血）

血漿グルコース、インスリン、およびグリコシル化ヘモグロビンは、自動分析装置 (Hitachi-Roche p800、F. Hoffmann-La Roche Ltd.) を使用して評価されます。 スイス）

総血漿抗酸化能（母親および臍帯血中）

市販のキット（分光測光器）を使用して測定します。

血漿脂溶性抗酸化物質（母親および臍帯血中）

血漿ビタミンE、レチノール、カロテン、コエンザイムQ10およびコエンザイムQ9は質量分析法によって測定されます。

抗酸化酵素活性（母親および臍帯血中）

エリトロサイト膜カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびスーパーオキシドジスムターゼ酵素は、分光測光法によって測定されます。

カルボニルタンパク質（母親および臍帯血中）

カルボニルタンパク質の測定は、市販のキット（分光測光法）を使用して行われます。

脂質の酸化的損傷（母親および臍帯血内）

市販のキット（分光光度法およびELISA）を使用した、尿および血漿中の4-ヒドロキシノネナールおよびイソプロスタン、および血漿および赤血球膜中のヒドロペルオキシドの測定

DNA への酸化的損傷 (母親および臍帯血内)

市販のキット (ELISA) による尿および血漿中の 8-ヒドロキシグアノシンの測定。

炎症誘発性および抗炎症性シグナル (母親および臍帯血内)

一部の母体血漿および臍帯血漿の炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン (IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1ra、および TNF Srii α) ）、一部のアディポカイン（アディポネクチン、アディプシン、レジスチン、PAI 活性、インスリン、レプチン）およびマイオカイン（イリシン）は、Luminex xMAP テクノロジーの採用によって測定されます。

骨バイオマーカー (母親および臍帯血中)

骨代謝に関連するさまざまなバイオマーカー (ACTH、DKK-1、FGF-23、オステオカルシン、OPN-オステオポンチン、オステオプロテゲリン、PTH、および SOST) が Luminex xMAP テクノロジーで測定されます。

肥満関連タンパク質の発現（母親および臍帯血）

グルココルチコイド受容体;ペルオキシソーム増殖活性化受容体 (PPAR); β-11 ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ I 型 (11βHSD1) とβ-11 ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ II 型 (11βHSD2) は、母親と臍帯血、および母親と新生児の口腔粘膜で評価されます。

さらに、胎児および出生後の脂肪組織の発達に深く関与する 4 つの遺伝子が選択されました。 2 つは受容体です: グルココルチコイド受容体と PPAR-γ、2 つは代謝酵素です: β-11 ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ I 型または 11βHSD1、および 11 β-ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ II 型または 11βHSD2。 非常に重要なのは、別のプロモーターの使用と mRNA によって同じ遺伝子から生成される PPAR-γ1 と PPAR-γ2 です。 私たちは、ポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロット技術によって、母体および臍帯血漿中のこのようなタンパク質とパラオキソナーゼ/アリールエステラーゼ 1 (PON1) 濃度を測定します。

母と子の人体計測と体組成（ゲスタフィトス）

母親と子供の身長はスケール（Seca 22、ハンブルク）を使用して記録されます。 母親と子供の両方に対して体組成の包括的分析（DXA、Hologic Discovery QDR、Nasdaq）が実施されます。 また、母親と子供の両方の体重（Inbody R20、Biospace、韓国）およびウエストと首周りも記録します。

母と子の血圧と安静時心拍数（ゲスタフィトス）

母と子の両方で、5分間の安静後、収縮期血圧と拡張期血圧、および心拍数を3回測定します（オムロン ホールドープ）。

母と子の栄養状態（ゲスタフィトス）

食物摂取頻度調査票および地中海食遵守度調査票を実施します。 栄養補助食品の使用についても記録されます。

母親と子供の身体活動、座位行動、および睡眠の質

加速度計（ActigraphGT3X+、米国フロリダ州ペンサコーラ製）を手首に9日間連続で装着し、身体活動、座位行動、睡眠関連行動（入眠潜時、効率など）を評価します。
加速度の変化は、子どもでは5秒エポック、母親では60秒エポックで記録されます。
データは、活動の総量と強度（平均身体活動強度）、エネルギー消費量、およびさまざまな強度（低強度（座位）、軽強度、中強度、高強度、中高強度）で1日あたりに費やされた分数について収集されます。睡眠の質は、専用のActisleepソフトウェアを使用して記録されます。

子どもの健康関連体力：PREFITバッテリー

筋力、心肺持久力、バランス、スピード、および運動協調性・敏捷性は、それぞれ以下のPREFITバッテリーテストを用いて評価されます：20mシャトルランテスト、ハンドグリップダイナモメトリー、立ち幅跳びテスト、片足立ちバランステスト、および4×10mシャトルランテスト。 PREFITバッテリーは、就学前児童の身体的フィットネスを評価するための実行可能で信頼性が高く、最大限かつ有効なツールです。

脳構造、脳血流、および脳機能の構造的および機能的磁気共鳴画像法による評価（Gestafitos）

MRIはグラナダ大学の脳・精神・行動研究センター（CIMCYC）で実施されます。 チームメンバーであるイレーネ・エステバン＝コルネホ博士は、過去に資金提供を受けた研究（例えば、子供の脳への運動効果を評価するランダム化比較試験であるACTIVEBRAINSプロジェクト）の神経画像領域を統括してきました。 彼女はオーストラリアのモナシュ認知・臨床神経科学研究所で2回の研究滞在を完了し、高度なMRI分析の修士号を取得しており、権威ある学術誌Neuroimageに掲載されたACTIVEBRAINSプロジェクトの最初の2編の脳に関する論文の筆頭著者です。 エステバン＝コルネホ博士はまた、ノースイースタン大学およびピッツバーグ大学において、運動と脳の健康に関する第一人者（エリクソンKI、クレイマーAF、ヒルマンCH）と共同研究を行ってきました。 エリクソン博士と神経科学者のマリーナ・ロペス＝ソラも現在のプロジェクトチームの一員です。

認知（ゲスタフィトス）

実行機能の3つの主要な側面を評価します：

1. 認知的抑制：ストループテストにより評価。単語の意味と一致しないインクの色を識別する際の干渉を3つの条件で評価します。

2. 認知的柔軟性：2つの独立したテストで評価：

   デザインフルエンシーテスト：参加者が異なるルールの下で60秒以内に独自のデザインを作成する3段階の条件からなり、柔軟性、創造性、視覚的パターン生成を評価します。

   トレイルメイキングテスト：視覚探索速度、注意力、精神的柔軟性、作業記憶、運動機能を評価する5つの条件。

3. 作業記憶：コンピューター化されたn-back課題（MRIセクション参照）で評価。情報を同時に保存・処理する能力を評価します。
4. 知能：カウフマン簡易知能検査（KBIT）で評価。言語的知能と非言語的知能の下位検査を含みます。

学業成績（ゲスタフィトス）

1. ウッドコック＝ムニョスIIIバッテリー：ウッドコック＝ジョンソンIII（WJ III）のスペイン語適応版で、言語、数学、科学を評価する22のサブテストで構成されています。選択されたサブテストは、数学の流暢さ、計算、理解力、ライティングを評価するために使用されます。
2. 学校の成績：保護者は、評価が行われる学年度の子どもの学校の成績も提供するよう求められます。

その他の運動、認知、言語発達スケール：

1. ベイリー乳幼児発達スケール第3版（BSID-III）
2. ウェクスラー児童用知能検査
3. BENCIバッテリー（コンピューター化児童神経心理評価バッテリー）

遺伝学的およびエピジェネティクス解析（ジェスタフィトス）

小児より頬粘膜検体を採取し、FTO遺伝子多型rs9939609およびMC4R遺伝子多型rs17782313の発現を解析します。
DNAはWhatmann®ペーパー支持体と有機抽出法を用いて唾液より抽出し、品質と量に最適化します。
検体はNanoDrop 2000分光光度計（ThermoScientific）で定量し、~5 ng/µLに調整後、TaqManプローブ（Applied Biosystems）を用いてRealTime ABI PRISM® 7900 HTでジェノタイピングを行います。
不成功の検体は特異的プライマーで増幅・シーケンスし、3130 HID Genetic Analyzer（Applied Biosystem）で解析します。
DNAとRNAはQIAamp DNA Mini KitおよびDNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）で抽出し、Qiacubeロボットで処理します。

酸化ストレスと抗酸化防御（胎盤トレーニング）

脂溶性抗酸化物質（トコフェロール、補酵素Q10およびQ9、レチノール）の胎盤内含有量はHPLCで分析され、一酸化窒素と総抗酸化能はABTS法で分析されます。

• タンパク質への酸化的損傷：市販キットを用いたカルボニル化タンパク質（分光光度法）。
• 脂質への酸化的損傷：市販キットを用いた4-ヒドロキシノネナールおよびイソプロスタン（分光光度法およびELISA法）。 DNAへの酸化的損傷：市販キットを用いた8-ヒドロキシグアノシン（ELISA法）。

バイオジェネシス、オートファジー、ミトコンドリア融合-分裂過程のマーカー発現（胎盤トレーニング）

ミトコンドリア動態の変化とその品質管理は、観察された知見を説明するための重要な側面です。

したがって、ウェスタンブロッティングまたはRT-PCRを用いて、分裂（Drp1、Fis1、OPA1）、融合（Mfn1、Mfn2）、生合成（PGC1α、Tfam、Sirt1、Nrf1、Nrf2）およびオートファジー（PARKIN2、PINK1、Beclin-1、ATG8、ATG5、ATG12、VDAC1）のミトコンドリアプロセスを分析します。

微量元素および超微量元素（胎盤トレーニング）

胎盤サンプル中の必須元素（Ca、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Se）または有害元素（Hg、V、Cr、As、Cd、Pb、Ni）の総含有量の測定は、メインハード型ネブライザー（Glass Expansion、Romainmotier）を装着し、He衝突セルを装備したICP-MS装置（Agilent 7500、Agilent Technologies、東京、日本）を用いて行われます。

ゲノムおよびメチル化（Placentraining）

サンプルは「遺伝子解析セクション」で以前に説明した通りに処理されます。 ゲノムおよびメチル化解析はパイロシーケンシング法によって実施されます。 これはFTOおよびMC4R遺伝子の検出のために行われます。 胎盤からのゲノムDNAは、推奨プロトコルに従ってDNeasy Blood&Tissue Kit（キアゲンN.V, Hi.GE）を使用して単離されます。 DNAの品質および量を確認後、FTOおよびMC4R遺伝子のプロモーター領域は、事前設計されたPyroMark CpGアッセイを用いて増幅されます。 これらのプライマーを使用した領域増幅により、領域内のCG部位のメチル化状態を直接定量することが可能になります。 まず、PyroMark PCRキット（QIAGEN N.V, Hi.GE）を使用してPCRによりFTOおよびMC4Rの対象領域を増幅します。このキットはメチル化され得るCGヌクレオチドの標識を可能にします。 反応生成物（サンプルおよび遺伝子ごとに1つ）は精製され、シーケンシング反応に使用されます。

候補遺伝子発現および低分子RNA解析（胎盤トレーニング）

関与する代謝経路をよりよく理解するために、候補遺伝子の研究、および遺伝子型-発現-環境の関係を確立することを可能にするmiRNAの決定（Small RNA Sequencing解析による）を実施します。

mRNAおよびmiRNA分析のために、胎盤RNAはメーカーの指示に従って「RNeasy Mini」キット（Qiagen）を用いて取得されます。 RNAの完全性は「RNA 6000 Nano chip」（Agilent）を使用し、Bionalalyzer 2100（Agilent）で分析され、濃度はNanoDrop 2000（ThermoFisher Scientific）で計算されます。

候補遺伝子（IL6、CXCL8、TNF-アルファ、CSF3、BDNF；FTO、MC4RおよびKL klotho（KL））の発現を研究するために、事前設計されたTaqMan Gene Expression assays（ThermoFisher Scientific）が使用されます。

標的および非標的メタボロミクスとリピドミクス解析

標的代謝物解析は、液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせて実施します。 脂質種の抽出は、MTBEを用いて血漿サンプルから抽出されます。 抽出されたサンプル10μLを、逆相カラムを装備したUPLC 1290（アジレント・テクノロジー社、バルセロナ、スペイン）に適用し、QTOF質量分析計モデル6545（アジレント・テクノロジー社、バルセロナ、スペイン）に結合します。 データは、正および負のエレクトロスプレーモードで収集されます。 MassHunter（アジレント・テクノロジー社、バルセロナ、スペイン）およびRソフトウェアを使用して、品質管理を用いてデータを収集、抽出、整列、フィルタリング、正規化します。 非標的代謝物解析は、液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせて実施します。 代謝物の抽出は、メタノールを用いて血漿サンプルから抽出されます。

毒性（胎盤形成）

遊離バイオ活性フェノールの濃度は、多クラス超高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（UHPLC-MS/MS）により測定されます。 以下のフェノール類が評価されます：

ビスフェノールA；パラベン：メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン；ベンゾフェノン類（BzP）：BzP-1、BzP-2、BzP-3、BzP-6、BzP-8、4-ヒドロキシ-BzP。 胎盤中のパーフルオロアルキル物質の濃度は、塩補助液-液抽出と分散液-液微抽出を組み合わせ、UHPLC-MS/MSにより評価されます。 以下のパーフルオロアルキル物質が測定されます：PFHxA、PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnA、PFDoA、PFTrA、PFHxS、PFOS。

炎症性、抗炎症性、血管新生および血管形成マーカー（プラセントトレーニング）

ルミネックスxMAP技術（ミリポア、ダルムシュタット、ドイツ）キットを使用して、胎盤のフラクタルカイン、IL-1α、IL-1β、IL-RA、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子2、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来成長因子-AA、単球走化性タンパク質-1、血管内皮成長因子を評価します。 これらの測定には、ヒト敗血症マグネティックビードパネル3マルチプレックスアッセイ（カタログ番号HTH17MAG-14K）を使用します。