妊娠期运动对母婴健康的影响 (GESTAFIT)

实验性的：格斯塔菲托斯

这是一项纵向研究，是妊娠与体能（GESTAFIT）项目的延续。 主要目的是评估孕期同步体育锻炼计划（在GESTAFIT项目下开展）对四岁后代的身体成分、体能水平、大脑结构以及运动、认知和语言发育的影响。

其他：运动干预

运动干预将分为两组进行，每组将有 12-13 名参与者。从妊娠第 16 周到分娩，各组每周训练 3 天（每次 60 分钟）。 运动干预组将经历不同阶段的培训： a) 学习阶段：这将涉及干预计划、我们要达到的目标以及我们将如何执行； b) 运动学习阶段：理论和实践课程，解释运动和人体工程学基本模式； c) 体能训练阶段：训练课程旨在改善体质和减轻体重，训练课程侧重于分娩时正确的骨盆活动。强度将根据妊娠周数和每位孕妇在锻炼计划中进行调整心率。 这些课程将包括一项混合工作，由将实施肌肉和心血管调节的回路组成。

其他：对照组

常规护理，非运动治疗。

实验性的：胎盘训练

这是一项回顾性研究，旨在分析参与GESTAFIT项目女性的胎盘状况，该项目实施了一项同步体育锻炼计划。 这种严谨的设计将使我们能够验证核心假设：孕期运动将在与妊娠并发症相关的胎盘代谢通路中产生更大改善，并与更好的妊娠结局和新生儿结局相关。

其他：运动干预

运动干预将分为两组进行，每组将有 12-13 名参与者。从妊娠第 16 周到分娩，各组每周训练 3 天（每次 60 分钟）。 运动干预组将经历不同阶段的培训： a) 学习阶段：这将涉及干预计划、我们要达到的目标以及我们将如何执行； b) 运动学习阶段：理论和实践课程，解释运动和人体工程学基本模式； c) 体能训练阶段：训练课程旨在改善体质和减轻体重，训练课程侧重于分娩时正确的骨盆活动。强度将根据妊娠周数和每位孕妇在锻炼计划中进行调整心率。 这些课程将包括一项混合工作，由将实施肌肉和心血管调节的回路组成。

其他：对照组

常规护理，非运动治疗。

源自胰岛素抵抗稳态模型评估 (HOMA-IR) 的胰岛素敏感性

胰岛素敏感性将源自胰岛素抵抗的稳态模型评估 (HOMA-IR)，其将使用公式 [空腹胰岛素 (μIU/mL) x 空腹葡萄糖 (mg/dL)]/405 计算。

产妇体重增加（公斤）

母亲体重增加将定义为从基线测量到最后一次测量的体重变化

新生儿胰岛素葡萄糖指数

新生儿胰岛素敏感性将通过葡萄糖/胰岛素比率进行评估。

收缩压和舒张压 (mmHg)

收缩压和舒张压 (mmHg) 将在休息 5 分钟后测量，在 2 个不同的场合（两次试验之间间隔 2 分钟），测量者坐下 (Omron Health Care Europe B.V. Hoolddorp)。 将选择两次试验中的最低值进行分析。

静息心率 (bpm)

静息心率 (bpm) 将在休息 5 分钟后测量，在 2 个不同的场合（两次试验之间间隔 2 分钟），测量者坐下 (Omron Health Care Europe B.V. Hoolddorp)。 将选择两次试验中的最低值进行分析。

地中海饮食评分

地中海饮食评分根据怀孕期间对铁、钙和叶酸的特定需求进行调整，将用于评估对传统地中海饮食模式的依从性。

心肺适能 (Vo2max)

将执行修改后的 Bruce 协议以估计最大摄氧量 (VO2max)，并将用作衡量心肺健康的指标。

心肺适能（6 分钟步行测试中的米数）

我们执行 6 分钟步行测试，测量每个参与者在 6 分钟内沿着 45.7 m 的矩形路线可以步行的最大距离（以米为单位）。

肌肉力量（公斤）

握力测试将用作强度测量

灵活性（厘米）

背部划痕测试将用作柔韧性的测量

体力活动和久坐行为（分钟）

加速度计将用于客观地评估身体活动和久坐时间。 女性将被要求连续 9 天佩戴三轴加速度计（ActiSleep+，美国佛罗里达州彭萨科拉），从她们收到监测器的同一天开始（例如 周一收到加速度计的参与者将携带该设备到下周的周二）。 将指示参与者全天（24 小时）将加速度计佩戴在用松紧带固定的手腕上。 将计算参与轻度、中度和中度强度 PA 的时间（以分钟为单位）和久坐时间。 该加速度计以前曾在妊娠中使用过，其方法与本协议中所述的方法类似。

睡眠行为（通过加速度计）

与睡眠相关的行为，例如睡眠开始、睡眠潜伏期、总睡眠时间、觉醒次数和持续时间以及睡眠效率将通过使用三轴加速度计（ActiSleep+，Pensacola，Florida，United States）进行客观计算。 此类ActiSleep加速度计数据的数据分析将通过其专用软件（Actilife）进行。

匹兹堡睡眠质量指数

它将用于评估 l 个月时间间隔内的睡眠质量和干扰。

失眠症状问卷

失眠症状的存在将通过在孕妇中验证的失眠症状问卷进行测量。

生活质量（短期健康调查 36）

我们将使用短期健康调查 36 来评估与健康相关的生活质量。

流行病学研究-抑郁量表问卷

孕妇产前抑郁水平将通过流行病学研究中心抑郁量表问卷进行评估，该量表在怀孕期间得到验证并广泛使用。

状态特质焦虑指数。

焦虑水平将通过国家特质焦虑指数进行评估。

不宁腿综合症拘留问卷

“不宁腿综合症”在很大程度上决定了很多孕妇的生活质量，与她们的抑郁程度和睡眠质量有关。 西班牙文版的不宁腿综合症拘留问卷将用于评估该综合症的存在和严重程度。

Oswestry 残疾指数评分

将使用西班牙语版本的 Oswestry 残疾指数评分评估腰痛

疼痛视觉模拟量表

还将使用疼痛视觉模拟量表评估腰痛强度

6项女性性功能指数

将使用 6 项女性性功能指数来评估性功能。 该工具由六个问题组成：欲望、唤醒、润滑、性高潮、满足和疼痛。 每个问题都可以从 0 到 5 打分，然后相加得到总分。

正面健康

“积极的健康”将通过以下问卷进行评估：

1. 特质元情绪量表
2. 正面和负面影响表
3. 生活满意度量表
4. 包含 10 个项目的 Connor-Davidson 复原力量表

血液学

红细胞计数、血细胞比容、血红蛋白、血小板、白细胞和红细胞平均红细胞体积将通过 Coulter (Brand) 定量。

脂质概况（在母亲和脐带血中）

将使用自动分析仪（Hitachi-Roche p800, F. Hoffmann-La Roche Ltd. 瑞士）

血糖曲线（在母亲和脐带血中）

将使用自动分析仪（Hitachi-Roche p800，F. Hoffmann-La Roche Ltd.）评估血浆葡萄糖、胰岛素和糖基化血红蛋白。 瑞士）

血浆总抗氧化能力（母血和脐带血）

它将使用商业套件（分光光度法）进行测量。

血浆脂溶性抗氧化剂（在母亲和脐带血中）

血浆维生素 E、视黄醇、胡萝卜素、辅酶 Q10 和辅酶 Q9 将通过质谱法测量

抗氧化酶活性（在母亲和脐带血中）

Eritrocite 膜过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶将通过分光光度法测量。

羰基蛋白（在母亲和脐带血中）

羰基蛋白的测量将通过使用商业试剂盒（分光光度法）来完成。

脂质氧化损伤（母体和脐带血）

使用商业试剂盒（分光光度法和 ELISA）测量尿液和血浆中的 4-羟基壬烯醛和异前列腺素以及血浆和红细胞膜中的氢过氧化物

DNA 氧化损伤（在母亲和脐带血中）

通过商业试剂盒 (ELISA) 测量尿液和血浆中的 8-羟基鸟苷。

促炎和抗炎信号（在母亲和脐带血中）

一些母体和脐带血浆促炎和抗炎细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α、IL-1ra 和 TNF Srii α )、一些脂肪因子（脂联素、脂肪素、抵抗素、PAI 活性、胰岛素和瘦素）和肌因子（鸢尾素）将通过使用 Luminex xMAP 技术进行测量。

骨生物标志物（在母亲和脐带血中）

与骨代谢相关的各种相关生物标志物（ACTH、DKK-1、FGF-23、骨钙素、OPN-骨桥蛋白、骨保护素、PTH 和 SOST）将使用 Luminex xMAP 技术进行测量。

肥胖相关蛋白表达（在母亲和脐带血中）

糖皮质激素受体；过氧化物酶体增殖激活受体 (PPAR)；将在母体和脐带血以及母亲和新生儿的口腔粘膜中评估 I 型 beta-11 羟基类固醇脱氢酶 (11βHSD1) 和 II 型 beta-11 羟基类固醇脱氢酶 (11βHSD2)。

此外，还选择了4个高度参与胎儿和出生后脂肪组织发育的基因；两个是受体：糖皮质激素受体和 PPAR-γ，两个是代谢酶：β-11 羟基类固醇脱氢酶 I 型或 11βHSD1 和 11β-羟基类固醇脱氢酶 II 型或 11βHSD2。 非常重要的是 PPAR-γ1 和 PPAR-γ2，它们是通过不同的启动子使用和 mRNA 从同一基因产生的。 我们将通过聚合酶链反应和蛋白质印迹技术测量母体和脐带血浆中的此类蛋白质以及对氧磷酶/芳基酯酶 1 (PON1) 浓度。

母亲与儿童的体格测量与身体成分（Gestafitos）

母婴身高将使用身高尺（Seca 22，汉堡）进行测量。 将对母婴双方进行全面的身体成分分析（DXA，Hologic Discovery QDR，纳斯达克）。 我们还将记录母婴双方的体重（Inbody R20，毕晟，韩国）以及腰围和颈围。

母婴血压与静息心率（妊娠期肥胖研究）

母亲与孩子将分别在休息5分钟后，使用欧姆龙霍尔多普血压计测量三次收缩压、舒张压及心率。

母亲与儿童营养状况（妊娠期营养）

将采用食物频率问卷和地中海饮食依从性问卷进行调查。 营养补充剂的使用情况也将被记录。

母亲与儿童的身体活动、久坐行为及睡眠质量

我们将使用连续佩戴九天的腕戴式加速度计（ActigraphGT3X+，美国佛罗里达州彭萨科拉）评估身体活动、久坐行为及睡眠相关行为（入睡潜伏期、睡眠效率等）。 儿童将以5秒为时段记录加速度变化，母亲则以60秒为时段。 数据将采集活动总量与强度（平均身体活动强度）、能量消耗，以及每日在不同强度（低强度/久坐、轻度、中度、剧烈及中高强度）下的持续时间（分钟）。同时将使用专用Actisleep软件记录睡眠质量。

儿童健康相关体适能：PREFIT测试组合

将使用以下PREFIT系列测试分别评估肌肉力量、心肺适能、平衡能力、速度及运动协调-敏捷性：20米往返跑测试、握力计测试、立定跳远测试、单腿平衡测试和4×10米往返跑测试。 PREFIT系列测试是一种可行、可靠、全面且有效的学龄前儿童体能评估工具。

脑结构、脑血流量及脑功能通过结构与功能磁共振成像（Gestafitos）

MRI检查将在格拉纳达大学大脑、心理与行为研究中心（CIMCYC）进行。 团队成员Irene Esteban-Cornejo博士曾负责协调先前资助研究的神经影像领域（例如ACTIVEBRAINS项目——一项评估运动对儿童大脑影响的随机对照试验）。 她曾在澳大利亚莫纳什认知与临床神经科学研究所完成两次研究访问，拥有高级MRI分析硕士学位，并且是ACTIVEBRAINS项目前两篇脑科学论文的第一作者，这两篇论文均发表于著名期刊《Neuroimage》。 Esteban-Cornejo博士还在美国东北大学和匹兹堡大学与运动与脑健康领域的顶尖专家（Erickson KI、Kramer AF和Hillman CH）合作研究。 Erickson博士及神经科学家Marina López-Solà也是当前项目团队的成员。

认知（格斯特菲托斯）

执行功能的三个关键方面将被评估：

1. 认知抑制：通过斯特鲁普测试进行评估，该测试包含三种条件，评估在识别词义与墨水颜色不匹配的词语时的干扰效应。

2. 认知灵活性：通过两个独立测试进行评估：

   设计流畅性测试：包含三个渐进条件，参与者在60秒内根据不同规则创建独特设计，评估灵活性、创造力和视觉模式生成能力。

   轨迹制作测试：包含五个条件，评估视觉搜索速度、注意力、心理灵活性、工作记忆和运动功能。

3. 工作记忆：通过计算机化的n-back任务（参见MRI部分）进行评估，该任务评估同时存储和处理信息的能力。
4. 智力：通过考夫曼简明智力测验（KBIT）进行评估，该测验包含语言和非语言智力的子测试。

学业表现（格斯塔菲托斯）

1. 伍德考克-穆尼奥斯III成套测验：伍德考克-约翰逊III（WJ III）的西班牙语改编版本，由22项分测验组成，评估语言、数学和科学能力。将选用部分分测验来评估数学流畅性、计算能力、理解能力和写作能力。
2. 学校成绩：还将要求家长提供孩子在接受评估学年的学校成绩。

其他运动、认知和语言发展量表：

1. 贝利婴幼儿发展量表第三版（BSID-III）
2. 韦氏儿童智力量表
3. BENCI成套测验（儿童计算机化神经心理评估成套测验）

遗传与表观遗传学分析（Gestafitos）

将从儿童收集颊黏膜样本，用于分析FTO基因多态性rs9939609和MC4R基因多态性rs17782313的表达。 将使用Whatmann®滤纸载体和经质量与产量优化的有机提取方法从唾液中提取DNA。 样本将通过NanoDrop 2000分光光度计（ThermoScientific）进行定量，标准化至约5 ng/µL后，使用TaqMan探针（Applied Biosystems）在实时ABI PRISM® 7900 HT系统上进行基因分型。 未成功的样本将通过特异性引物进行扩增和测序，并使用3130 HID遗传分析仪（Applied Biosystem）进行分析。 DNA与RNA将使用QIAamp DNA Mini Kit和DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）进行提取，并通过Qiacube自动化工作站处理。

氧化应激与抗氧化防御（胎盘训练）

将通过高效液相色谱法分析胎盘中脂溶性抗氧化剂（生育酚、辅酶Q10和Q9以及视黄醇）的含量，并通过ABTS法测定一氧化氮和总抗氧化能力。

• 蛋白质氧化损伤：使用商业试剂盒（分光光度法）检测羰基蛋白质。
• 脂质氧化损伤：使用商业试剂盒（分光光度法和ELISA）检测4-羟基壬烯醛和异前列腺素。 DNA氧化损伤：使用商业试剂盒（ELISA）检测8-羟基鸟苷。

生物发生、自噬、线粒体融合-分裂过程标志物的表达（胎盘训练）

线粒体动力学及其质量控制的变化是解释所观察结果的关键方面。

因此，通过Western blotting或RT-PCR技术，检测线粒体的分裂过程（Drp1、Fis1和OPA1）、融合过程（Mfn1和Mfn2）、生物合成过程（PGC1α、Tfam、Sirt1、Nrf1、Nrf2）以及自噬过程（PARKIN2、PINK1、Beclin-1、ATG8、ATG5、ATG12、VDAC1）。

微量与超微量矿物质（胎盘营养）

胎盘样本中这些必需元素（钙、镁、锰、铁、铜、锌、硒）或有毒元素（汞、钒、铬、砷、镉、铅、镍）总含量的测定将通过配备Meinhard型雾化器（Glass Expansion，罗曼莫蒂耶）和氦碰撞池的ICP-MS仪器（安捷伦7500，安捷伦科技，日本东京）进行。

基因组学和甲基化分析（胎盘训练）

样本将按照先前在“遗传分析部分”中所述的方式进行加工。 基因组和甲基化分析将采用焦磷酸测序法进行。 此方法将用于检测FTO和MC4R基因。 胎盘中的基因组DNA将按照推荐方案使用DNeasy Blood&Tissue Kit进行分离（Qiagen N.V, Hi.GE）。 在检查DNA的质量和数量后，将使用预设计的PyroMark CpG检测试剂盒扩增FTO和MC4R基因的启动子区域。 使用这些引物进行区域扩增将使我们能够直接定量该区域内CpG位点的甲基化状态。 首先，我们将使用PyroMark PCR试剂盒（QIAGEN N.V, Hi.GE）通过PCR扩增FTO和MC4R的目标区域，该试剂盒能够标记可能发生甲基化的CpG核苷酸。 反应产物（每个样本和基因各一份）将被纯化并用于测序反应。

候选基因表达与小RNA分析（胎盘训练）

为了更好地理解所涉及的代谢途径，我们将进行候选基因的研究，以及通过小RNA测序分析确定miRNA，从而建立基因型-表达-环境关系。

对于mRNA和miRNA分析，胎盘RNA将通过"RNeasy Mini"试剂盒（Qiagen）按照制造商说明获取。RNA完整性将通过"RNA 6000 Nano chip"（Agilent）使用Bionalalyzer 2100（Agilent）进行分析，浓度将通过NanoDrop 2000（ThermoFisher Scientific）计算。

将使用预设计的TaqMan基因表达检测试剂（ThermoFisher Scientific）研究候选基因的表达：IL6、CXCL8、TNF-α、CSF3、BDNF；FTO、MC4R和KL Klotho（KL）。

靶向和非靶向代谢组学与脂质组学分析

靶向代谢组学分析将采用液相色谱-质谱联用技术进行。 脂质物种提取将使用甲基叔丁基醚从血浆样本中萃取。 取10微升提取样本上样至配备反相色谱柱的UPLC 1290系统（安捷伦科技，西班牙巴塞罗那），并与QTOF质谱仪型号6545（安捷伦科技，西班牙巴塞罗那）联用。 数据将在正负电喷雾模式下采集。 将使用MassHunter软件（安捷伦科技，西班牙巴塞罗那）和R软件通过质控对数据进行采集、提取、对齐、过滤和标准化处理。 非靶向代谢组学分析将采用液相色谱-质谱联用技术进行。 代谢物提取将使用甲醇从血浆样本中萃取。

毒性（胎盘训练）

游离生物活性酚类物质的浓度将通过多类超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）进行测定。 将评估以下酚类物质：

双酚A；对羟基苯甲酸酯类：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯；二苯甲酮类（BzP）：BzP-1、BzP-2、BzP-3、BzP-6、BzP-8、4-羟基-BzP。 胎盘中的全氟烷基物质浓度将通过盐辅助液液萃取结合分散液液微萃取与UHPLC-MS/MS联用技术进行评估。 将测量以下全氟烷基物质：PFHxA、PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnA、PFDoA、PFTrA、PFHxS和PFOS。

炎症、抗炎、血管生成和血管新生标志物（胎盘训练）

我们将采用Luminex xMAP技术（德国达姆施塔特Millipore公司）试剂盒检测胎盘中的Fractalkine、IL-1α、IL-1β、IL-RA、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子-AA、单核细胞趋化蛋白-1、血管内皮生长因子。 上述检测将使用人类脓毒症磁珠面板3多重检测试剂盒（货号：HTH17MAG-14K）。