Wpływ ćwiczeń podczas ciąży na zdrowie matki i płodu (GESTAFIT)

Eksperymentalny: Gestafitos

To jest badanie podłużne, które stanowi kontynuację Projektu Ciąża i Sprawność (GESTAFIT). Głównym celem jest ocena wpływu programu równoległych ćwiczeń fizycznych w czasie ciąży (opracowanego w ramach projektu GESTAFIT) na skład ciała, sprawność fizyczną, strukturę mózgu oraz rozwój motoryczny, poznawczy i językowy potomstwa w wieku czterech lat.

Inny: Interwencja ruchowa

Interwencja ruchowa zostanie przeprowadzona w dwóch grupach, tak aby każda grupa liczyła 12-13 uczestników. Grupy będą trenować 3 dni w tygodniu (60 min na sesję) od 16 tygodnia ciąży do porodu. Grupa ćwiczeń interwencyjnych przejdzie przez różne fazy treningu: a) Faza uczenia się: która obejmie plan interwencji, cele, nad którymi chcemy pracować, oraz sposób, w jaki będziemy to realizować; b) Faza nauki ruchu: sesje teoretyczne i praktyczne z wyjaśnieniem ruchów i podstawowych wzorców ergonomicznych; oraz c) Faza treningu sprawności fizycznej: z sesjami treningowymi mającymi na celu poprawę sprawności i utratą wagi oraz sesjami treningowymi ukierunkowanymi na prawidłową mobilizację miednicy przed porodem. Intensywność zostanie dostosowana podczas programu ćwiczeń w zależności od tygodnia ciąży i każdej ciąży tętno. Sesje będą składać się z pracy mieszanej, składającej się z obwodów, w których zostanie wdrożona zarówno kondycja mięśniowa, jak i sercowo-naczyniowa.

Inny: Grupa kontrolna

Standardowa opieka, bez ćwiczeń.

Eksperymentalny: Trening łożyska

To jest badanie retrospektywne, którego celem jest analiza stanu łożysk kobiet uczestniczących w projekcie GESTAFIT, w ramach którego opracowano równoległy program ćwiczeń fizycznych. Ten rygorystyczny projekt pozwoli nam przetestować naszą centralną hipotezę, że ćwiczenia podczas ciąży spowodują większe poprawy w szlakach metabolicznych łożyska związanych z powikłaniami ciążowymi i są powiązane z lepszymi wynikami ciąży i noworodka.

Inny: Interwencja ruchowa

Interwencja ruchowa zostanie przeprowadzona w dwóch grupach, tak aby każda grupa liczyła 12-13 uczestników. Grupy będą trenować 3 dni w tygodniu (60 min na sesję) od 16 tygodnia ciąży do porodu. Grupa ćwiczeń interwencyjnych przejdzie przez różne fazy treningu: a) Faza uczenia się: która obejmie plan interwencji, cele, nad którymi chcemy pracować, oraz sposób, w jaki będziemy to realizować; b) Faza nauki ruchu: sesje teoretyczne i praktyczne z wyjaśnieniem ruchów i podstawowych wzorców ergonomicznych; oraz c) Faza treningu sprawności fizycznej: z sesjami treningowymi mającymi na celu poprawę sprawności i utratą wagi oraz sesjami treningowymi ukierunkowanymi na prawidłową mobilizację miednicy przed porodem. Intensywność zostanie dostosowana podczas programu ćwiczeń w zależności od tygodnia ciąży i każdej ciąży tętno. Sesje będą składać się z pracy mieszanej, składającej się z obwodów, w których zostanie wdrożona zarówno kondycja mięśniowa, jak i sercowo-naczyniowa.

Inny: Grupa kontrolna

Standardowa opieka, bez ćwiczeń.

Wrażliwość na insulinę na podstawie homeostatycznego modelu oceny insulinooporności (HOMA-IR)

Wrażliwość na insulinę zostanie wyprowadzona z homeostatycznego modelu oceny insulinooporności (HOMA-IR), który zostanie obliczony przy użyciu wzoru [insulina na czczo (μIU/ml) x glukoza na czczo (mg/dl)]/405.

Przyrost masy ciała matki (kg)

Przyrost masy ciała matki zostanie zdefiniowany jako zmiana masy ciała od pomiaru podstawowego do ostatniego pomiaru

Noworodkowy indeks insulinowo-glukozowy

Noworodkowa wrażliwość na insulinę zostanie oceniona na podstawie stosunku glukoza/insulina.

Skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi (mmHg)

Skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi (mmHg) zostanie zmierzone po 5 minutach odpoczynku, przy 2 różnych okazjach (z 2 minutami między próbami), z osobą siedzącą (Omron Health Care Europe B.V. Hoolddorp). Do analizy zostanie wybrana najniższa wartość z dwóch prób.

Tętno spoczynkowe (bpm)

Tętno spoczynkowe (bpm) zostanie zmierzone po 5 minutach odpoczynku, przy 2 różnych okazjach (z 2 minutami między próbami), u osoby siedzącej (Omron Health Care Europe B.V. Hoolddorp). Do analizy zostanie wybrana najniższa wartość z dwóch prób.

Ocena diety śródziemnomorskiej

Śródziemnomorska Ocena Diety w wersji dostosowanej do specyficznych potrzeb ciąży w zakresie Fe, Ca i kwasu foliowego posłuży do oceny przestrzegania tradycyjnego śródziemnomorskiego schematu żywieniowego.

Sprawność krążeniowo-oddechowa (Vo2max)

Zmodyfikowany protokół Bruce'a zostanie przeprowadzony w celu oszacowania maksymalnego poboru tlenu (VO2max) i zostanie wykorzystany jako miara wydolności krążeniowo-oddechowej.

Wydolność krążeniowo-oddechowa (metry w teście 6-minutowego marszu)

Przeprowadzamy 6-minutowy test marszu, który mierzy maksymalną odległość (w metrach), jaką każdy uczestnik może przejść w ciągu 6 minut wzdłuż prostokątnej trasy o długości 45,7 m.

Siła mięśni (kg)

Jako miarę siły zostanie wykorzystany test siły uścisku dłoni

Elastyczność (cm)

Jako miarę elastyczności zostanie wykorzystany test zarysowania

Aktywność fizyczna i siedzący tryb życia (w minutach)

Akcelerometria posłuży do obiektywnej oceny aktywności fizycznej i czasu spędzanego w pozycji siedzącej. Kobiety zostaną poproszone o noszenie trójosiowego akcelerometru (ActiSleep+, Pensacola, Floryda, Stany Zjednoczone) przez 9 kolejnych dni, począwszy od tego samego dnia, w którym otrzymają monitor (np. uczestnicy, którzy otrzymają akcelerometr w poniedziałek, będą nosić urządzenie do wtorku następnego tygodnia). Uczestnicy zostaną poproszeni o noszenie akcelerometru przez cały dzień (24 godziny) na nadgarstku przymocowanym elastycznym paskiem. Obliczony zostanie czas (w minutach) wykonywania ćwiczeń PA o lekkiej, umiarkowanej i umiarkowanej intensywności oraz czas siedzący. Ten akcelerometr był wcześniej używany w ciąży z podobną metodologią, jak opisano w niniejszym protokole.

Zachowania podczas snu (poprzez akcelerometrię)

Zachowania związane ze snem, takie jak początek snu, opóźnienie snu, całkowity czas snu, liczba i czas trwania przebudzeń oraz efektywność snu zostaną obiektywnie obliczone za pomocą akcelerometru trójosiowego (ActiSleep+, Pensacola, Floryda, Stany Zjednoczone). Analiza danych takich danych akcelerometrycznych ActiSleep zostanie przeprowadzona za pomocą specjalnego oprogramowania (Actilife).

Indeks jakości snu w Pittsburghu

Posłuży do oceny jakości snu i jego zakłóceń w okresie 1 miesiąca.

Kwestionariusz objawów bezsenności

Obecność objawów bezsenności będzie mierzona za pomocą Kwestionariusza Objawów Bezsenności, walidowanego u kobiet w ciąży.

Jakość życia (Krótka ankieta dotycząca stanu zdrowia 36)

Do oceny jakości życia związanej ze zdrowiem użyjemy Skróconej Ankiety Zdrowia 36.

Kwestionariusz Badań Epidemiologicznych – Skala Depresji

Poziomy depresji przedporodowej w ciąży zostaną ocenione za pomocą kwestionariusza Centrum Badań Epidemiologicznych – Skali Depresji, który jest zwalidowany i szeroko stosowany w ciąży.

Indeks stanu lęku jako cechy.

Poziomy lęku zostaną ocenione za pomocą Indeksu Stanu Cechy Lęku.

Kwestionariusz Zatrzymania zespołu niespokojnych nóg

„Zespół niespokojnych nóg” w dużej mierze determinuje jakość życia wielu ciężarnych i jest powiązany z poziomem depresji i jakością snu. Hiszpańska wersja kwestionariusza Detention of Restless Legs Syndrome zostanie wykorzystana do oceny obecności i nasilenia tego zespołu.

Wynik indeksu niepełnosprawności Oswestry

Ból krzyża zostanie oceniony za pomocą hiszpańskiej wersji Oswestry Disability Index

Wizualna analogowa skala bólu

Intensywność bólu krzyża zostanie również oceniona za pomocą wizualnej analogowej skali bólu

6-itemowy wskaźnik funkcji seksualnych kobiet

Do oceny funkcji seksualnych zostanie wykorzystany 6-itemowy Wskaźnik Kobiecych Funkcji Seksualnych. Narzędzie to składa się z sześciu pytań: pożądanie, podniecenie, lubrykacja, orgazm, satysfakcja i ból. Każde pytanie można ocenić w skali od 0 do 5, a następnie zsumować, aby uzyskać łączny wynik.

Pozytywne zdrowie

„Pozytywne zdrowie” zostanie ocenione za pomocą następujących kwestionariuszy:

1. Skala meta-nastroju cechy
2. Harmonogram pozytywnego i negatywnego wpływu
3. Skala Satysfakcji z Życia
4. 10-itemowa skala odporności Connora-Davidsona

Hematologia

Liczba erytrocytów, hematokryt, hemoglobina, płytki krwi, leukocyty i średnia objętość krwinek czerwonych zostaną określone ilościowo przez Coultera (Brand).

Profil lipidowy (we krwi matki i pępowinowej)

Całkowity poziom lipoprotein o dużej gęstości i lipoprotein o małej gęstości w osoczu oraz trójglicerydy (wszystkie w mg/dl) zostaną ocenione przy użyciu automatycznego analizatora (Hitachi-Roche p800, F. Hoffmann-La Roche Ltd. Szwajcaria)

Profil glikemiczny (we krwi matki i pępowinowej)

Stężenie glukozy, insuliny i hemoglobiny glikozylowanej w osoczu będzie oceniane za pomocą automatycznego analizatora (Hitachi-Roche p800, F. Hoffmann-La Roche Ltd. Szwajcaria)

Całkowita pojemność antyoksydacyjna osocza (we krwi matki i pępowinowej)

Zostanie zmierzona za pomocą komercyjnego zestawu (spektrofotometria).

Przeciwutleniacze rozpuszczalne w tłuszczach w osoczu (we krwi matki i pępowinowej)

Witamina E, retinol, karoten, koenzym Q10 i koenzym Q9 w osoczu zostaną zmierzone za pomocą spektrometrii mas

Aktywność enzymów antyoksydacyjnych (we krwi matki i pępowinowej)

Enzymy katalazy błonowej erytrocytu, peroksydazy glutationowej i dysmutazy ponadtlenkowej będą mierzone za pomocą spektrofotometrii.

Białka karbonylowe (we krwi matki i pępowinowej)

Pomiar białek karbonylowych zostanie wykonany przy użyciu komercyjnego zestawu (spektrofotometria).

Oksydacyjne uszkodzenie lipidów (we krwi matki i pępowinowej)

Pomiar 4-hydroksynonenalu i izoprostanu w moczu i osoczu oraz wodoronadtlenków w osoczu i błonie erytrocytów za pomocą komercyjnych zestawów (spektrofotometria i ELISA)

Oksydacyjne uszkodzenie DNA (we krwi matki i pępowinowej)

pomiar 8-hydroksyguanozyny w moczu i osoczu za pomocą komercyjnych zestawów (ELISA).

Sygnał pro- i przeciwzapalny (we krwi matki i pępowinowej)

Niektóre prozapalne i przeciwzapalne cytokiny osocza matki i pępowiny (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ i TNF-α, IL-1ra i TNF Srii α ), niektóre adipokiny (adiponektyna, adypsyna, rezystyna, aktywna PAI, insulina i leptyna) oraz miokiny (iryzyna) będą mierzone za pomocą technologii Luminex xMAP.

Biomarkery kości (we krwi matki i pępowinowej)

Różne istotne biomarkery związane z metabolizmem kości (ACTH, DKK-1, FGF-23, osteokalcyna, OPN-Osteopontyna, osteoprotegeryna, PTH i SOST) zostaną zmierzone za pomocą technologii Luminex xMAP.

Ekspresja białek związanych z otyłością (we krwi matki i pępowinowej)

Receptor glukokortykoidowy; receptor aktywowany przez proliferację peroksysomów (PPAR); dehydrogenaza beta-11 hydroksysteroidowa typu I (11βHSD1) i dehydrogenaza beta-11 hydroksysteroidowa typu II (11βHSD2) będą oznaczane we krwi matki i pępowinowej oraz w błonie śluzowej jamy ustnej matki i noworodka.

Ponadto wyselekcjonowano 4 geny silnie zaangażowane w płodowy i pourodzeniowy rozwój tkanki tłuszczowej; dwa to receptory: receptor glukokortykoidowy i PPAR-γ, a dwa to enzymy metaboliczne: dehydrogenaza beta-11 hydroksysteroidowa typu I lub 11βHSD1 i dehydrogenaza 11 beta-hydroksysteroidowa typu II lub 11βHSD2. Duże znaczenie mają PPAR-γ1 i PPAR-γ2, które są generowane z tego samego genu przez zastosowanie alternatywnego promotora i mRNA. Zmierzymy takie białka oraz stężenie paraoksonazy/aryloesterazy 1 (PON1) w osoczu matki i pępowiny metodami reakcji łańcuchowej polimerazy i techniką Western Blot.

Antropometria i skład ciała matki i dziecka (Gestafitos)

Wysokość matki i dziecka zostanie zarejestrowana za pomocą wagi (Seca 22, Hamburg). Kompleksowa analiza składu ciała zostanie przeprowadzona zarówno dla matki, jak i dziecka (DXA, Hologic Discovery QDR, Nasdaq). Zarejestrujemy również wagę (Inbody R20, Biospace, Korea) oraz obwód talii i szyi zarówno u matki, jak i dziecka.

Ciśnienie krwi i tętno spoczynkowe matki i dziecka (Gestafitos)

Ciśnienie skurczowe i rozkurczowe oraz tętno będą mierzone trzykrotnie po 5 minutach odpoczynku (Omron Hoolddorp) zarówno u matki, jak i u dziecka.

Stan Odżywienia Matki i Dziecka (Gestafitos)

Zostanie przeprowadzony kwestionariusz częstotliwości spożycia żywności oraz kwestionariusz przestrzegania diety śródziemnomorskiej. Stosowanie suplementów diety również będzie rejestrowane.

Aktywność fizyczna, zachowania siedzące i jakość snu matki i dziecka

Ocenimy aktywność fizyczną, zachowania siedzące oraz zachowania związane ze snem (latencję, wydajność itp.) przy użyciu akcelerometrów (ActigraphGT3X+, Pensacola, Floryda, USA) noszonych na nadgarstku przez dziewięć kolejnych dni. Zmiany przyspieszenia będą rejestrowane w 5-sekundowych epokach dla dzieci i 60-sekundowych epokach dla matek. Dane będą zbierane dotyczące całkowitej objętości i intensywności aktywności (średnia intensywność aktywności fizycznej), wydatku energetycznego oraz liczby minut dziennie spędzonych przy różnych intensywnościach: niskiej (siedzącej), lekkiej, umiarkowanej, intensywnej i umiarkowanej do intensywnej. Jakość snu będzie również rejestrowana przy użyciu specjalnego oprogramowania Actisleep.

Sprawność fizyczna związana ze zdrowiem dziecka: Bateria PREFIT

Siłę mięśniową, wydolność krążeniowo-oddechową, równowagę, szybkość oraz koordynację ruchowo-zręcznościową oceniono za pomocą następujących testów baterii PREFIT: odpowiednio test wielokrotnych powtórzeń na dystansie 20m, dynamometria siły ścisku dłoni, test skoku w dal z miejsca, test równowagi na jednej nodze oraz test wielokrotnych powtórzeń 4x10m. Bateria PREFIT jest wykonalnym, wiarygodnym, maksymalnym i ważnym narzędziem do oceny sprawności fizycznej u dzieci w wieku przedszkolnym.

Struktura Mózgu, Przepływ Krwi w Mózgu i Funkcje Mózgu za Pomocą Strukturalnego i Funkcjonalnego Obrazowania Rezonansu Magnetycznego (Gestafitos)

Badanie MRI zostanie przeprowadzone w Centrum Badań nad Mózgiem, Umysłem i Zachowaniem (CIMCYC) na Uniwersytecie w Granadzie. Dr Irene Esteban-Cornejo, członkini zespołu, koordynowała obszar neuroobrazowania wcześniej finansowanych badań (np. projekt ACTIVEBRAINS, randomizowane badanie kontrolowane oceniające wpływ ćwiczeń na mózg u dzieci). Ukończyła dwa staże badawcze w Monash Institute of Cognitive and Clinical Neurosciences w Australii, posiada tytuł magistra w dziedzinie zaawansowanej analizy MRI i jest pierwszą autorką dwóch pierwszych artykułów dotyczących mózgu z projektu ACTIVEBRAINS, oba opublikowane w prestiżowym czasopiśmie Neuroimage. Dr Esteban-Cornejo pracowała również z czołowymi ekspertami w dziedzinie ćwiczeń i zdrowia mózgu (Erickson KI, Kramer AF i Hillman CH) na Northeastern University i University of Pittsburgh. Dr Erickson i neurobiolożka Marina López-Solà są również częścią obecnego zespołu projektowego.

Poznanie (Gestafitos)

Trzy kluczowe aspekty funkcji wykonawczych zostaną ocenione:

1. Hamowanie poznawcze: Oceniane za pomocą testu Stroopa, który obejmuje trzy warunki oceniające interferencję podczas identyfikowania koloru tuszu słów, które nie pasują do ich znaczenia.

2. Elastyczność poznawcza: Oceniana za pomocą dwóch niezależnych testów:

   Test Płynności Projektowania: Składa się z trzech progresywnych warunków, w których uczestnicy tworzą unikalne projekty według różnych zasad w ciągu 60 sekund, oceniając elastyczność, kreatywność i generowanie wzorów wizualnych.

   Test Łączenia Punktów: Pięć warunków oceniających szybkość wyszukiwania wzrokowego, uwagę, elastyczność umysłową, pamięć roboczą i funkcje motoryczne.

3. Pamięć robocza: Oceniana za pomocą skomputeryzowanego zadania n-back (patrz sekcja MRI), które ocenia zdolność do jednoczesnego przechowywania i przetwarzania informacji.
4. Inteligencja: Oceniana za pomocą Testu Krótkiej Inteligencji Kaufmana (KBIT), który obejmuje podtesty inteligencji werbalnej i niewerbalnej.

Wyniki w nauce (Gestafitos)

1. Bateria Woodcock-Muñoz III: Hiszpańska adaptacja baterii Woodcock-Johnson III (WJ III), składająca się z 22 podtestów oceniających język, matematykę i nauki ścisłe. Wybrane podtesty zostaną wykorzystane do oceny płynności matematycznej, obliczeń, rozumienia i pisania.
2. Oceny szkolne: Rodzice zostaną również poproszeni o podanie ocen szkolnych dziecka z roku/ów akademickich, w których przeprowadzane są oceny.

Inne skale rozwoju motorycznego, poznawczego i językowego:

1. Skale Bayleya do oceny rozwoju niemowląt, Trzecie wydanie (BSID-III)
2. Skala Inteligencji Wechslera dla Dzieci
3. Bateria BENCI (Komputerowa Bateria Neuropsychologiczna do Oceny Dzieci)

Analizy Genetyczne i Epigenetyczne (Gestafitos)

Próbki błony śluzowej policzka będą pobierane od dzieci w celu analizy ekspresji polimorfizmu genu FTO rs9939609 i polimorfizmu genu MC4R rs17782313. DNA będzie ekstrahowane ze śliny przy użyciu podkładek papierowych Whatmann® i metod ekstrakcji organicznej zoptymalizowanych pod kątem jakości i ilości. Próbki będą ilościowo oznaczane przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000 (ThermoScientific) i normalizowane do ~5 ng/µL przed genotypowaniem z sondami TaqMan (Applied Biosystems) na systemie RealTime ABI PRISM® 7900 HT. Nieudane próbki będą amplifikowane i sekwencjonowane przy użyciu specyficznych starterów oraz analizowane za pomocą analizatora genetycznego 3130 HID (Applied Biosystem). DNA i RNA będą ekstrahowane przy użyciu zestawów QIAamp DNA Mini Kit i DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) oraz przetwarzane za pomocą robota Qiacube.

Stres oksydacyjny i obrona antyoksydacyjna (Placentraining)

Zawartość rozpuszczalnych w tłuszczach przeciwutleniaczy (tokoferolu, koenzymu Q10 i Q9 oraz retinolu) w łożysku zostanie przeanalizowana za pomocą HPLC, a tlenku azotu i całkowitej zdolności antyoksydacyjnej metodą ABTS.

• Uszkodzenia oksydacyjne białek: białka karbonylowe przy użyciu komercyjnych zestawów (spektrofotometria).
• Uszkodzenia oksydacyjne lipidów: 4-hydroksynonenal i izoprostany przy użyciu komercyjnych zestawów (spektrofotometria i ELISA). Uszkodzenia oksydacyjne DNA: 8-hydroksyguanozyna za pomocą komercyjnych zestawów (ELISA).

Ekspresja markerów biogenezy, autofagii, procesów fuzji-fisji mitochondrialnej (Placentraining)

Zmiany w dynamice mitochondrialnej i ich kontroli jakości są kluczowym aspektem wyjaśniającym obserwowane wyniki.

Dlatego też, stosując Western-blotting lub RT-PCR, procesy mitochondrialne rozszczepienia (Drp1, Fis1 i OPA1), fuzji (Mfn1 i Mfn2), biogenezy (PGC1alpha, Tfam, Sirt1, Nrf1, Nrf2) i autofagii (PARKIN2, PINK1, Beclin-1, ATG8, ATG5, ATG12, VDAC1).

Pierwiastki śladowe i ultramałe (Placentraining)

Oznaczenie całkowitej zawartości tych niezbędnych (Ca, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn, Se) lub toksycznych pierwiastków (Hg, V, Cr, As, Cd, Pb, Ni) w próbkach łożyska zostanie przeprowadzone przy użyciu spektrometru mas z plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP-MS) (Agilent 7500, Agilent Technologies, Tokio, Japonia) wyposażonego w nebulizator typu Meinhard (Glass Expansion, Romainmotier) oraz komórkę kolizyjną z helem.

Genomika i metylacja (Placentraining)

Próbki będą przetwarzane zgodnie z wcześniejszym opisem w "Sekcji analiz genetycznych". Analizy genomowe i metylacji będą przeprowadzane metodą pirosekwencjonowania. Będzie to przeprowadzone w celu wykrycia genów FTO i MC4R. Genomowe DNA z łożysk będzie izolowane przy użyciu zestawu DNeasy Blood&Tissue Kit zgodnie z zalecanym protokołem (Qiagen N.V, Hi.GE). Po sprawdzeniu jakości i ilości DNA, promotory genów FTO i MC4R będą amplifikowane za pomocą wstępnie zaprojektowanych testów PyroMark CpG. Amplifikacja regionu przy użyciu tych starterów pozwoli nam bezpośrednio określić status metylacji CG w obrębie regionu. Najpierw wzmocnimy regiony zainteresowania FTO i MC4R za pomocą PCR przy użyciu zestawu PyroMark PCR Kit (QIAGEN N.V, Hi.GE), który umożliwia znakowanie nukleotydów CG podatnych na metylację. Produkty reakcji (jeden na próbkę i gen) zostaną oczyszczone i użyte do reakcji sekwencjonowania.

Analiza ekspresji genów kandydackich i analiza małych RNA (Placentraining)

Dla lepszego zrozumienia szlaków metabolicznych zaangażowanych w proces, przeprowadzimy badanie genów kandydujących, a także oznaczenie miRNA, co pozwoli nam ustalić zależność genotyp-ekspresja-środowisko (z analizą sekwencjonowania małych RNA).

Do analizy mRNA i miRNA, RNA łożyska zostanie pozyskane za pomocą zestawu "RNeasy Mini" (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Integralność RNA będzie analizowana przy użyciu "RNA 6000 Nano chip" (Agilent) z wykorzystaniem Bionalalyzer 2100 (Agilent), a stężenie będzie obliczane za pomocą NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific).

Wstępnie zaprojektowane testy ekspresji genów TaqMan (ThermoFisher Scientific) zostaną użyte do badania ekspresji genów kandydujących: IL6, CXCL8, TNF-alfa, CSF3, BDNF; FTO, MC4R i KL klotho (KL).

Analizy metabolomiki i lipidomiki ukierunkowanej i nieukierunkowanej

Analizy metabolomiki ukierunkowanej będą przeprowadzane przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ekstrakcja gatunków lipidowych będzie przeprowadzana z próbek osocza przy użyciu MTBE. Dziesięć µL ekstrahowanej próbki będzie aplikowane na układ UPLC 1290 (Agilent Technologies, Barcelona, Hiszpania) wyposażony w kolumnę fazy odwróconej sprzężoną ze spektrometrem mas QTOF model 6545 (Agilent Technologies, Barcelona, Hiszpania). Dane będą zbierane w dodatnim i ujemnym trybie elektrorozpylania. Oprogramowanie MassHunter (Agilent Technologies, Barcelona, Hiszpania) i R będą używane do zbierania, ekstrakcji, wyrównywania, filtrowania i normalizacji danych przy użyciu kontroli jakości. Analizy metabolomiki nieukierunkowanej będą przeprowadzane przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ekstrakcja metabolitów będzie przeprowadzana z próbek osocza przy użyciu metanolu.

Toksyny (Szkolenie łożyskowe)

Stężenia wolnych bioaktywnych fenoli będą oznaczane za pomocą wieloklasowej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (UHPLC-MS/MS). Ocenie poddane zostaną następujące fenole:

bisfenol A; parabeny: metyloparaben, etyloparaben, propyloparaben, butyloparaben; benzofenony (BzP): BzP-1, BzP-2, BzP-3, BzP-6, BzP-8, 4-hydroksy-BzP. Stężenia substancji perfluoroalkilowych w łożysku będą oceniane poprzez połączenie ekstrakcji ciecz-ciecz wspomaganej solą z mikroekstrakcją dyspersyjną ciecz-ciecz i UHPLC-MS/MS. Mierzone będą następujące substancje perfluoroalkilowe: PFHxA, PFHpA, PFOA, PFNA, PFDA, PFUnA, PFDoA, PFTrA, PFHxS i PFOS.

Markery zapalne, przeciwzapalne, waskulogenezy i angiogenezy (Placentraining)

Wykorzystamy zestawy technologii Luminex xMAP (Millipore, Darmstadt, Niemcy) do oceny łożyskowej fraktalkiny, IL-1α, IL-1β, IL-RA, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego, naskórkowego czynnika wzrostu, czynnika wzrostu fibroblastów 2, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, płytkopochodnego czynnika wzrostu-AA, białka chemoatraktantu monocytów-1, śródbłonkowego czynnika wzrostu naczyń. Do tych oznaczeń wykorzystamy wieloparametryczny test Human Sepsis Magnetic Bead Panel 3 (kat. Nr HTH17MAG-14K).