口腔マイクロバイオームに対する抗生物質治療と抽出の影響

仮説 第三大臼歯抜歯の治療プロトコルの一部として定期的に処方されるアモキシシリン (250 mg、1 日 3 回、5 日間) のコースは、安定した口腔マイクロバイオームの有意な変化を引き起こします。

主要なアウトカム指標は、以下を評価することです。

1. 口腔マイクロバイオームの 16 s r DNA 遺伝子配列決定によって評価された、指定された 5 つの時点でのさまざまな細菌の相対的存在量。
2. 既知の耐性遺伝子のマイクロアレイと機能的メタゲノミクスによって評価された、既知の抗生物質耐性遺伝子の相対的存在量と発現。

副次評価項目は、以下を評価することです。

1. 2 つの時点で唾液中の C 反応性タンパク質のレベルを測定することによる、口腔内の炎症の存在。
2. 炎症および感染の存在を監視するための治療前および治療後の最初の 1 週間の臨床徴候および症状。

定期的な外科的摘出が予定されており、研究に参加することに書面で同意した被験者が募集されます。 専門の顎顔面外科トレーニング（ML Co-A）を持つ経験豊富な臨床オペレーターが臨床治療を担当します。 抗生物質の処方は、症例の複雑さ、手術の難易度、および所要時間に基づいて行われます。 したがって、患者は無作為化されませんが、各グループで 15 人の患者を取得することに基づいています。 これは介入研究ではなく、患者が期待される標準治療を受けているため、リスクのあるグループはありません。 唾液は 7 つの観察時点 (ベースライン、1 週間、2 週間、3 週間、1 か月、3 か月、6 か月) で収集され、歯肉縁上プラーク サンプルは 4 つの観察時点 (ベースライン、1 週間、1 か月) で収集されます。 、 3ヶ月 ）。 抜歯または抗生物質治療を受けていない15人の被験者の対照群は、インフォームドコンセントを得た後に募集され、同じ7つの時点で追跡されます。

被験者は、サンプル収集が行われる前の夜に歯を磨くのを控えるように求められ、同様に歯科用うがい薬を使用しないように求められます。 収集時点とは別に、被験者は、研究期間中、「通常の」定期的な口腔衛生手順を維持するよう求められます。

唾液サンプルの収集のための 7 つの時点は次のとおりです。

ベースライン

1. 週
2. 週間
3. 週間

1ヶ月 3ヶ月 6ヶ月

プラーク サンプルの収集の 3 つの時点は次のとおりです。

ベースライン 1 週間

1ヶ月 3ヶ月

ベースラインサンプルの収集後、第三大臼歯の外科的抜歯が行われます。 被験者には、摘出後の指示と鎮痛剤がすべての被験者に与えられ、抗生物質が必要な被験者にはアモキシシリンが与えられます。 コンプライアンスは、患者に質問し、リコールの予約時にアモキシシリンの錠剤ラッパーストリップをチェックすることによってチェックされます. 対象者は、1 か月の試験期間中は洗口剤の使用を控えるよう求められ (まだ行っていない場合)、抗菌成分を含まない歯磨き粉が使用のために提供されます。

各被験者は、プロービング深度、臨床的付着損失、歯肉指数、プラーク指数、および歯肉刺激の測定を含むベースライン歯周検査を受け、口腔の健康状態が記録されます。

DNA抽出用のサンプルは、以下に説明するように、指定されたすべての時点で収集されます。 サンプルは朝、食事の少なくとも2時間後に採取されます プラークおよび唾液サンプルの収集は、Keijser et al（13）の説明に従って行われます。サンプルは朝に採取されます クライオバイアル（Salimetrics ) デバイスに受動的に唾液をよだれをたらすように被験者に依頼することによって。 サンプルはすぐに氷に入れ、-80℃で保存します。 滅菌マイクロブラシを使用して、頬側の歯の表面から歯肉縁上のプラーク サンプルを収集します。 サンプル収集後、ブラシの先端を切断し、エッペンドルフ チューブ内に-80℃で保存します。歯肉縁上プラークの収集は、6 本の歯 (16、11、24、41、36、および 44) に対して行います。

唾液サンプルをボルテックスし、2 セットの 0.3 ml 容量を、0.3 g のジルコニア シリカ ビーズを含む 2 つの滅菌済み 2 キャップ エッペンドルフ チューブに移します。

Ｃ反応性タンパク質ＥＬＩＳＡキット（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して、ベースラインおよび１週間でＣ反応性タンパク質レベルを測定するために、５０マイクロリットルの唾液を使用する。

０．２ｍｌのフェノールを添加し、ミニビーズビーターを２分間使用することにより、サンプルをホモジナイズする。 DNA抽出キット(Qiagen)を用いてDNAを抽出する。

16s r RNA ハイパー可変領域 V4 の増幅は、プライマーを使用して行われ、シーケンスは MiSeq プラットフォームを使用して実行されます。

耐性遺伝子のマイクロアレイと機能的メタゲノミクスは、Card et al (14) によって説明されているように実行されます。

被験者の治療 これは、術後に抗生物質を使用する場合と使用しない場合で、親知らずの外科的抜歯を受けている若年成人を調査する前向き縦断的観察コホート研究です。 抗生物質と鎮痛剤は、手術後に投与されます。

アモキシシリン 経口、1 日 3 回 250 mg を 5 日間 鎮痛薬 - Arcoxia 120 mg を 3 日間、パラセタモール 500 mg QID PRN を 3 日間、またはパラセタモール 1 g とリン酸コデイン 16 mg。 抗生物質の処方は、症例の複雑さ、外傷、処置の長さに基づく臨床的判断に基づいて行われます。 無作為化は行われません。 唾液は 5 つの観察時点 (ベースライン、1 週間、2 週間、3 週間、1 か月) で収集され、歯肉縁上プラーク サンプルは 3 つの観察時点 (ベースライン、1 週間、1 か月) で収集されます。コンプライアンスがチェックされます。患者に尋ね、リコールの予約時にアモキシシリンの錠剤ラッパーストリップを確認する.

有効性の評価 この研究は、新薬の有効性を調べるものではありません。 行われている治療手順は、従来の治療プロトコルに従っています。

安全性の評価 この研究は、新薬の安全性を目指しているわけではありません。 行われている治療手順は、従来の治療プロトコルに従っています。

統計分析。 小サブユニット リボソーム RNA 遺伝子 V4 ハイパー可変領域のバーコード化されたアンプリコン ライブラリは、V4 フォワード プライマー GTGCCAGCMGCCGCGGTAA および V4 リバース プライマー GGACTACHVGGGTWTCTAAT を使用してサンプルごとに生成されます。 :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. アンプリコン ライブラリーは等モル量でプールされ、イルミナ MiSeq システムによって配列決定されます。 シーケンス データは、QIIME (15) と UPARSE (16) パイプラインの組み合わせを使用して処理されます。 品質フィルタリングの後、読み取りは、UPARSE を使用して 97% の最小配列類似性で運用分類単位 (OTU) にクラスター化されます。 各クラスターの代表的な配列は、リボソーム データベース プロジェクト (RDP) 分類子を使用して、QIIME で 80% の信頼度で分類法に割り当てられます。

シーケンスの深さの違いを正規化するために、読み取りは同じ数の読み取り/サンプルでランダムにサブサンプリングされます。 log2 変換された OTU データの主成分分析 (PCA) と多様性統計 (Shannon Diversity Index)、Bray-Curtis Similarity Index、一元配置順列多変量分散分析 (PERMANOVA)、および類似度パーセンテージ (SIMPER) によるデータ削減が実行されます。 PAST ソフトウェア (17) を使用します。 PCA を使用して、潜在的なマイクロバイオーム クラスタリングを治療および来院ごとに視覚化します。 シャノン ダイバーシティ インデックスでは、分類群 (OTU) の数と、データセット全体に対する各 OTU の相対的な寄与が考慮されます。 Bray-Curtis Similarity Index は 0 と 1 の間でバインドされます。ここで、1 は 2 つのサンプルが同じ組成を持つことを意味し、0 は 2 つのサンプルが種を共有しないことを意味します。 このインデックスは、訪問 1 (ベースライン サンプル) と同じ個人からの他のすべての訪問の間のマイクロバイオームの類似性を評価するために適用されます。 このメソッドは、時間の微生物シフトを定量化できます。 独立したサンプルの T 検定を使用して、2 つの治療グループ間のマイクロバイオームの変化を比較します。 PERMANOVA は、マイクロバイオーム プロファイルが 2 つの治療グループ間で統計的に有意に異なるかどうかを評価するために使用されます。 SIMPER は、治療グループ間の違いに最も寄与する OTU を特定するために使用されます。

マイクロバイオーム分析の出力:

各サンプル タイプ (プラーク、および唾液) ごとに、各時点には、サンプルごとの正規化された読み取りカウントと、各 OTU のそれぞれの分類学的割り当てを含む OTU テーブルが含まれます。個々のサンプルごとのシャノン多様性指数と上記の統計分析。 重み付けされた UniFrac メトリックを使用したクラスター分析は、異なる時点での細菌の相対的存在量を分析するために使用されます。

ソースデータ/ドキュメントへのアクセス 治験関連のモニタリング、監査、およびソースデータ/ドキュメントへの IRB レビューのために、アクセスが許可されます。

品質管理と品質保証 標準的な臨床検査プロフォーマを使用してデータを収集し、管理者または RA スタッフが入力します。 臨床検査官は、経験豊富な臨床医からの入力に基づいて、必要に応じて調整され、フォームの使用方法と臨床的判断を下す方法をトレーニングされます。 すべての抜歯は同じ専門の臨床医によって行われ、サンプルの収集は訓練を受けた臨床検査官によって行われます。

倫理 抗生物質の処方は、臨床医の判断と症例の複雑さに基づいて行われます。これは受け入れられ日常的な治療法であるため、倫理的な問題は予想されません。

データの取り扱いと記録の保管 データは、データの収集方法について訓練を受け、指示された指定の臨床検査官によって収集されます。 事務スタッフとリサーチアシスタントがデータを入力します。 記録のハード コピーとソフト コピーは、調査責任者と他の 1 人の管理スタッフによって保管されます。 研究チーム以外は、このデータへのアクセスは許可されません。

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