Влияние лечения антибиотиками и экстракции на микробиом полости рта

Гипотеза Курс амоксициллина (250 мг три раза в день в течение пяти дней), обычно назначаемый как часть протокола лечения удаления третьих моляров, вызывает значительное изменение стабильного микробиома полости рта.

Основными показателями результатов являются оценка:

1. Относительная численность различных бактерий в 5 указанных моментов времени, оцененная с помощью секвенирования гена 16 s r ДНК микробиома полости рта.
2. Относительная распространенность и экспрессия известных генов устойчивости к антибиотикам, оцененная с помощью микроматрицы известных генов устойчивости и функциональной метагеномики.

Вторичные показатели результатов заключаются в оценке:

1. Наличие воспаления в полости рта путем измерения уровня С-реактивного белка в слюне в 2 временных точках.
2. Клинические признаки и симптомы до и в течение первой недели после лечения для наблюдения за наличием воспаления и инфекции.

Субъекты, запланированные для планового хирургического удаления, которые дадут письменное согласие на участие в исследовании, будут набраны. За выполнение клинического лечения будет отвечать опытный клинический оператор со специальной подготовкой по челюстно-лицевой хирургии (ML Co-A). Назначение антибиотиков будет основываться на сложности случая, сложности оперативного хирургического вмешательства и затраченного времени. Поэтому пациенты не будут рандомизированы, а будут основаны на получении 15 пациентов в каждой группе. Это не интервенционное исследование, и нет группы риска, поскольку пациенты получают ожидаемый стандарт лечения. Слюна будет собираться в семи точках времени наблюдения (исходный уровень, одна неделя, две недели, три недели, один месяц, три месяца и шесть месяцев), а образцы наддесневого зубного налета будут собираться в четырех точках времени наблюдения (исходный уровень, одна неделя, один месяц). , три месяца ). Контрольная группа из 15 субъектов, которые не подвергались удалению зубов или лечению антибиотиками, будет набрана после получения информированного согласия и будет наблюдаться в течение тех же семи временных точек.

Субъектов попросят воздержаться от чистки зубов в ночь перед сбором образцов и аналогичным образом попросят не пользоваться ополаскивателями для зубов. Помимо временных точек сбора, субъектов попросят поддерживать свои «нормальные» обычные процедуры гигиены полости рта на протяжении всего исследования.

Семь моментов времени для сбора образцов слюны:

Базовый уровень

1. неделя
2. недели
3. недели

1 месяц 3 месяца 6 месяцев

Три момента времени для сбора образцов зубного налета:

Базовый уровень 1 неделя

1 месяц 3 месяца

После сбора исходных образцов будет проведено хирургическое удаление третьего моляра. Субъекту будут даны инструкции после экстракции и анальгетики для облегчения боли для всех субъектов и амоксициллин для тех, кто нуждается в антибиотиках. Соблюдение режима будет проверено путем опроса пациента и проверки полосок, обертывающих таблетки амоксициллина, во время повторных приемов. Субъекту будет предложено воздержаться от использования какого-либо ополаскивателя для рта в течение одного месяца исследования (если он еще этого не сделал), и для использования будет предоставлена ​​зубная паста без антибактериального содержания.

Каждый субъект пройдет базовое пародонтальное обследование, включая измерения глубины зондирования, потери клинического прикрепления, десневого индекса, индекса зубного налета и раздражения десен, а также будет записано их состояние здоровья полости рта.

Образцы для выделения ДНК будут собираться во все указанные моменты времени, как описано ниже. Образцы будут взяты утром, по крайней мере, через два часа после еды Сбор образцов налета и слюны будет проводиться, как описано Keijser et al (13). Образцы будут взяты утром. 5 мл слюны будут собраны с использованием криопробирок (Salimetrics). ), попросив субъекта пассивно пустить слюну в устройство. Образцы будут немедленно помещены в лед и сохранены при -800C. Стерильная микрощетка будет использоваться для сбора образцов наддесневого зубного налета с щечных поверхностей зубов. После сбора образца кончик щетки будет срезан и помещен в пробирку Эппендорфа при температуре -80°C. Сбор наддесневого зубного налета будет проводиться для шести зубов (16, 11, 24, 41, 36 и 44).

Образцы слюны будут встряхиваться, и два набора по 0,3 мл будут перенесены в две стерильные пробирки Эппендорф с двумя крышками с 0,3 г гранулами диоксида кремния из циркония.

50 мкл слюны будут использоваться для измерения уровня С-реактивного белка в начале исследования и в течение одной недели с использованием набора ИФА для определения С-реактивного белка (Salimetrics).

Образцы будут гомогенизированы путем добавления 0,2 мл фенола и использования мини-бисерной мешалки в течение 2 минут. ДНК будет извлечена с использованием набора для выделения ДНК (Qiagen).

Амплификация гипервариабельной области 16s r РНК V4 будет проводиться с использованием праймеров, а секвенирование будет выполняться с использованием платформы MiSeq.

Микрочип для устойчивых генов и функциональная метагеномика будут выполняться, как описано Card et al (14).

Лечение субъектов Это проспективное продольное обсервационное когортное исследование, в котором изучались молодые люди, перенесшие хирургическое удаление зуба мудрости с применением антибиотиков и без них в послеоперационном периоде. После операции назначают антибиотики и анальгетики.

Амоксициллин Внутрь, 3 раза в день по 250 мг в течение 5 дней Анальгетики - Аркоксиа 120 мг в течение трех дней и Парацетамол 500 мг четыре раза в день PRN в течение 3 дней или Парацетамол 1 г плюс 16 мг кодеина фосфата. Назначение антибиотиков будет основываться на клинической оценке, основанной на сложности случая, травме и продолжительности процедуры. Рандомизация производиться не будет. Слюна будет собираться в пяти точках времени наблюдения (исходный уровень, одна неделя, две недели, три недели и один месяц), а образцы наддесневого зубного налета будут собираться в трех точках времени наблюдения (исходный уровень, одна неделя и один месяц). Будет проверено соответствие. для, спрашивая пациента и проверяя полоски обертки таблетки амоксициллина на встречах отзыва.

Оценка эффективности В исследовании не рассматривается эффективность нового лекарственного средства. Лечебные процедуры проводятся в соответствии с общепринятым протоколом лечения.

Оценка безопасности Исследование не рассматривает безопасность нового препарата. Лечебные процедуры проводятся в соответствии с общепринятым протоколом лечения.

Статистический анализ. Библиотеки ампликонов со штрих-кодом гипервариабельной области V4 гена малой субъединицы рибосомной РНК будут созданы для каждого образца с использованием прямого праймера V4 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA и обратного праймера V4 GGACTACHVGGGTWTCTAAT, как описано Шлоссом в http://www.mothur.org/wiki/File. :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Библиотеки ампликонов будут объединены в эквимолярных количествах и секвенированы с помощью системы Illumina MiSeq. Данные секвенирования будут обрабатываться с использованием комбинации конвейеров QIIME (15) и UPARSE (16). После качественной фильтрации чтения будут сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) с минимальным сходством последовательностей 97% с использованием UPARSE. Репрезентативной последовательности каждого кластера будет присвоена таксономия с использованием классификатора проекта рибосомной базы данных (RDP) с достоверностью 80% в QIIME.

Чтобы нормализовать различия в глубине секвенирования, считывания будут случайным образом разделены на подвыборки с равным количеством считываний на выборку. Будет выполнено сокращение данных с помощью анализа основных компонентов (PCA) на преобразованных в log2 данных OTU и статистике разнообразия (индекс разнообразия Шеннона), индексе сходства Брея-Кертиса, одностороннем пермутационном многомерном дисперсионном анализе (PERMANOVA) и проценте сходства (SIMPER). с использованием программного обеспечения PAST (17). PCA будет использоваться для визуализации потенциальной кластеризации микробиома при лечении и посещении. Индекс разнообразия Шеннона учитывает количество таксонов (OTU) и относительный вклад каждой OTU во весь набор данных. Индекс сходства Брея-Кертиса находится в диапазоне от 0 до 1, где 1 означает, что две выборки имеют одинаковый состав, а 0 означает, что две выборки не принадлежат ни одному виду. Этот индекс будет применяться для оценки сходства микробиомов между визитом 1 (исходный образец) и всеми другими визитами одного и того же человека. Этот метод позволяет количественно оценить микробный сдвиг во времени. Т-тест независимых образцов будет использоваться для сравнения изменений микробиома между двумя группами лечения. PERMANOVA будет использоваться для оценки того, отличаются ли профили микробиома статистически значимо между двумя группами лечения. SIMPER будет использоваться для определения OTU, которые вносят наибольший вклад в различия между группами лечения.

Результат анализа микробиома:

Для каждого типа образца (налет и слюна) и каждой временной точки будет включена таблица OTU с нормализованным количеством прочтений на образец с соответствующим таксономическим присвоением для каждой OTU; Индекс разнообразия Шеннона для отдельной выборки и статистический анализ, упомянутый выше. Кластерный анализ с использованием взвешенных показателей UniFrac будет использоваться для анализа относительной численности бактерий в разные моменты времени.

Доступ к исходным данным/документам Будет разрешен доступ для связанного с испытаниями мониторинга, аудита и обзора IRB к исходным данным/документам.

Контроль качества и обеспечение качества Для сбора данных будет использоваться стандартная форма клинического обследования, которая вводится административным персоналом или персоналом RA. Клинические эксперты будут обучены тому, как использовать форму и делать клинические суждения на основе информации, полученной от опытных клиницистов и, при необходимости, откалиброванной. Все удаления зубов будут выполняться одним и тем же опытным клиницистом, а сбор образцов будет проводиться обученными клиническими экспертами.

Этика Назначение антибиотиков будет основываться на суждении врача и сложности случая. Никаких этических проблем не ожидается, поскольку это общепринятый и рутинный способ лечения.

Обработка данных и ведение записей Данные будут собирать назначенные клинические эксперты, которые будут обучены и проинструктированы, как собирать данные. Административный персонал и научные сотрудники будут вводить данные. Печатные и бумажные копии записей будут храниться у главного следователя и еще одного административного сотрудника. Доступ к этим данным не будет разрешен, кроме исследовательской группы.

Финансы и страхование Стоматологического факультета HKU (PG Funds)

Политика публикации Выводы и данные будут опубликованы в международных рецензируемых журналах и на аналогичных международных конференциях.