Effekten av antibiotikabehandling och extraktion på det orala mikrobiomet

Hypotes En kur med amoxicillin (250 mg, tre gånger dagligen i fem dagar), rutinmässigt ordinerad som en del av behandlingsprotokollet för tredje molar extraktioner orsakar en signifikant förändring av den stabila orala mikrobiomet.

De primära utfallsmåtten är att bedöma:

1. Relativ förekomst av olika bakterier vid 5 angivna tidpunkter bedömd genom 16 s r DNA-gensekvensering av det orala mikrobiomet.
2. Relativt överflöd och uttryck av kända antibiotikaresistensgener bedömda av en mikroarray av kända resistenta gener och funktionell metagenomik.

Sekundära utfallsmått är att bedöma:

1. Förekomst av inflammation i munhålan genom att mäta nivåerna av C-reaktivt protein i saliven vid 2 tidpunkter.
2. Kliniska tecken och symtom före och under den första veckan efter behandling för att övervaka förekomsten av inflammation och infektion.

Försökspersoner schemalagda för rutinkirurgiska extraktioner som ger ett skriftligt samtycke till att vara en del av studien kommer att rekryteras. En erfaren klinisk operatör med specialistutbildning för käkkirurgi (ML Co-A) kommer att ansvara för att utföra klinisk behandling. Förskrivning av antibiotika kommer att baseras på ärendets komplexitet, svårighetsgraden av det operativa kirurgiska ingreppet och den tid det tar. Därför kommer patienter inte att randomiseras utan baserat på att få 15 patienter i varje grupp. Detta är inte en interventionsstudie och det finns ingen riskgrupp eftersom patienterna får den förväntade vårdstandarden. Saliv kommer att samlas in vid sju observationstidpunkter (baslinje, en vecka, två veckor, tre veckor, en månad, tre månader och sex månader) och supragingivala plackprover kommer att samlas in vid fyra observationstillfällen (baslinje, en vecka, en månad) , tre månader ). En kontrollgrupp på 15 försökspersoner som inte genomgår tandextraktioner eller antibiotikabehandling kommer att rekryteras efter att ha erhållit informerat samtycke och kommer att följas upp under samma sju tidpunkter.

Försökspersonerna kommer att uppmanas att avstå från att borsta tänderna kvällen innan provtagningen ska utföras och på samma sätt uppmanas att inte använda munvatten. Förutom tidpunkter för insamling kommer försökspersoner att uppmanas att behålla sina "normala" rutiner för munhygien under hela studien.

Sju tidpunkter för insamling av salivprover är:

Baslinje

1. vecka
2. Veckor
3. Veckor

1 månad 3 månader 6 månader

Tre tidpunkter för insamling av plackprover är:

Baslinje 1 vecka

1 månad 3 månader

Efter insamling av baslinjeproverna kommer kirurgisk extraktion av den tredje molartanden att utföras. Försökspersonen kommer att få instruktioner efter extraktion och smärtstillande medel för smärtlindring för alla försökspersoner och amoxicillin för dem som behöver antibiotika. Överensstämmelse kommer att kontrolleras genom att fråga patienten och kontrollera tablettförpackningsremsorna av amoxicillin vid återkallelsemötena. Försökspersonen kommer att uppmanas att avstå från att använda munsköljning under studieperioden på en månad (om de inte redan gjort det) och en tandkräm utan antibakteriellt innehåll kommer att tillhandahållas för användning.

Varje försöksperson kommer att genomgå en baslinje parodontal undersökning, inklusive mätningar av sonderingsdjup, klinisk anknytningsförlust, gingivalindex, plackindex och tandköttsirritation och deras orala hälsostatus kommer att registreras.

Prover för DNA-extraktion kommer att samlas in vid alla angivna tidpunkter enligt beskrivningen nedan. Prover kommer att tas på morgonen minst två timmar efter måltid Samling av plack- och salivprover kommer att göras enligt beskrivningen av Keijser et al (13). Prover kommer att tas på morgonen 5 ml saliv kommer att samlas in med hjälp av kryovialer (Salimetrics). ) genom att be personen att passivt dregla in saliv i enheten. Prover kommer att placeras i is omedelbart och förvaras vid -800C. En steril mikroborste kommer att användas för att samla supragingivala plackprover från de buckala dentala ytorna. Efter provtagningen kommer spetsen på borsten att skäras och förvaras i ett Eppendorf-rör vid -800C. Supragingival plackuppsamling kommer att göras för sex tänder (16, 11, 24, 41, 36 och 44).

Salivprover kommer att vortexas och två uppsättningar av 0,3 ml volymer kommer att överföras till två sterila Eppendorf-rör med två lock med 0,3 g zirkoniumoxidkiselpärlor.

50 mikroliter saliv kommer att användas för mätning av C - reaktivt proteinnivåer vid baslinjen och en vecka med C- Reactive Protein ELISA-kit (Salimetrics).

Proverna kommer att homogeniseras genom att tillsätta 0,2 ml fenol och använda en mini pärlvisp i 2 minuter. DNA kommer att extraheras med hjälp av ett DNA-extraktionskit (Qiagen).

Amplifiering av 16s r RNA hypervariabel region V4 kommer att göras med hjälp av primers och sekvenseringen kommer att utföras med MiSeq-plattformen.

Mikroarray för de resistenta generna och funktionell metagenomik kommer att utföras enligt beskrivningen av Card et al (14).

Behandling av försökspersoner Detta är en prospektiv, longitudinell, observations-, kohortstudie som undersöker unga vuxna som genomgår kirurgisk extraktion av en visdomstand med och utan antibiotika postoperativt. Antibiotika och analgetika kommer att ges postoperativt.

Amoxicillin Intra oralt, tre gånger dagligen 250 mg i 5 dagar Analgetika - Arcoxia 120mg i tre dagar och Paracetamol 500 mg QID PRN i 3 dagar eller Paracetamol 1 g Plus 16 mg Kodeinfosfat. Förskrivningen av antibiotika kommer att baseras på klinisk bedömning baserad på ärendets komplexitet, trauma och längd på proceduren. Ingen randomisering kommer att utföras. Saliv kommer att samlas in vid fem observationstidpunkter (baslinje, en vecka, två veckor, tre veckor och en månad) och supragingivala plackprover kommer att samlas in vid tre observationstider (baslinje, en vecka och en månad). Efterlevnaden kommer att kontrolleras. för genom att fråga patienten och kontrollera tablettförpackningsremsorna av amoxicillin vid återkallelsemötena.

Bedömning av effekt Studien undersöker inte effekten av ett nytt läkemedel. Behandlingsprocedurerna som utförs är enligt det konventionella behandlingsprotokollet.

Bedömning av säkerhet Studien ser inte på säkerheten för ett nytt läkemedel. Behandlingsprocedurerna som utförs är enligt det konventionella behandlingsprotokollet.

Statistisk analys. Streckkodade amplikonbibliotek av den lilla subenheten ribosomala RNA-genen V4 hypervariabel region kommer att genereras för var och en av proverna med hjälp av V4 forward primer GTGCCAGCMGCCGCGGTAA och V4 reverse primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT som beskrivs av Schloss i http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Amplikonbiblioteken kommer att slås samman i ekvimolära mängder och sekvenseras med hjälp av Illumina MiSeq-system. Sekvenseringsdata kommer att bearbetas med en kombination av QIIME (15) och UPARSE (16) pipelines. Efter kvalitetsfiltrering kommer läsningarna att klustras i Operational Taxonomic Units (OTU) med en minimal sekvenslikhet på 97 % med UPARSE. Den representativa sekvensen för varje kluster kommer att tilldelas en taxonomi med hjälp av klassificeraren Ribosomal Database Project (RDP) med 80 % tillförlitlighet för QIIME.

För att normalisera för skillnader i sekvenseringsdjup, kommer läsningarna att subsamplas slumpmässigt vid lika antal läsningar/prov. Datareduktion genom principal component analysis (PCA) på log2 transformerade OTU-data och diversitetsstatistiken (Shannon Diversity Index), Bray-Curtis Similarity Index, envägs permutationell multivariat variansanalys (PERMANOVA) och likhetsprocent (SIMPER) kommer att utföras med PAST programvara (17). PCA kommer att användas för att visualisera den potentiella mikrobiomklustringen genom behandling och genom besök. Shannon Diversity index tar hänsyn till antalet taxa (OTU) och det relativa bidraget från varje OTU till hela datasetet. Bray-Curtis Similarity Index är bundet mellan 0 och 1, där 1 betyder att två prover har samma sammansättning och 0 betyder att de två proverna inte delar någon art. Detta index kommer att användas för att bedöma likheten i mikrobiomer mellan besök 1 (baslinjeprov) och alla andra besök från samma individ. Denna metod gör det möjligt att kvantifiera mikrobiell förändring i tid. Oberoende prov T-test kommer att användas för att jämföra mikrobiomskiften mellan de två behandlingsgrupperna. PERMANOVA kommer att användas för att bedöma om mikrobiomprofilerna skiljer sig statistiskt signifikant mellan de två behandlingsgrupperna. SIMPER kommer att användas för att identifiera de OTU:er som bidrar mest till skillnaderna mellan behandlingsgrupperna.

Utdata för mikrobiomanalys:

Per varje provtyp (plack och saliv) och varje tidpunkt kommer att inkludera en OTU-tabell med normaliserade avläsningsantal per prov med respektive taxonomisk tilldelning för varje OTU; Shannon Diversity Index per enskilt prov och de statistiska analyser som nämns ovan. Klusteranalys med hjälp av viktade UniFrac-mått kommer att användas för att analysera den relativa förekomsten av bakterier vid olika tidpunkter.

Åtkomst till källdata/dokument Åtkomst kommer att tillåtas för testrelaterad övervakning, revisioner och IRB-granskning av källdata/dokument.

Kvalitetskontroll och kvalitetssäkring En standardproforma för klinisk undersökning kommer att användas för att samla in data och matas in av administrativ personal eller RA-personal. Kliniska examinatorer kommer att utbildas i hur man använder formuläret och gör kliniska bedömningar baserat på input från erfarna kliniker och vid behov kalibrerade. Alla tandutdragningar kommer att utföras av samma sakkunniga läkare och provtagningen kommer att göras av utbildade kliniska granskare.

Etik Förskrivning av antibiotika kommer att baseras på läkarens bedömning och ärendekomplexitet. Inga etiska problem förväntas eftersom detta är ett accepterat och rutinmässigt behandlingssätt.

Datahantering och journalföring Data kommer att samlas in av utsedda kliniska granskare som kommer att utbildas och instrueras hur man samlar in data. Administrativ personal och forskningsassistenter kommer att lägga in uppgifterna. Hårda och mjuka kopior av dokument kommer att förvaras av huvudutredaren och en annan administrativ personal. Ingen åtkomst till dessa uppgifter kommer att tillåtas förutom forskargruppen.

Finansiering och försäkring HKU Odontologiska fakulteten (PG-fonder)

Publikationspolicy Resultat och data kommer att publiceras i internationella peer-reviewade tidskrifter och vid liknande internationella konferenser.