항생제 치료 및 추출이 구강 마이크로 바이옴에 미치는 영향

가설 제3대구치 발치를 위한 치료 프로토콜의 일부로 일상적으로 처방되는 아목시실린(250mg, 5일 동안 매일 3회) 코스는 안정적인 구강 마이크로바이옴의 상당한 이동을 유발합니다.

주요 결과 측정은 다음을 평가하는 것입니다.

1. 구강 마이크로바이옴의 16s r DNA 유전자 시퀀싱에 의해 평가된 5개의 지정된 시점에서 서로 다른 박테리아의 상대적 풍부도.
2. 알려진 저항성 유전자의 마이크로어레이 및 기능적 메타게노믹스에 의해 평가된 알려진 항생제 저항성 유전자의 상대적 존재비 및 발현.

이차 결과 측정은 다음을 평가하는 것입니다.

1. 2개의 시점에서 타액 내 C-반응성 단백질의 수준을 측정하여 구강 내 염증의 존재.
2. 염증 및 감염의 존재를 모니터링하기 위한 치료 전 및 치료 후 첫 주 동안의 임상 징후 및 증상.

연구의 일부가 되는 것에 대해 서면 동의를 제공하는 일상적인 수술 추출이 예정된 피험자가 모집됩니다. 전문 상악안면외과 교육을 받은 숙련된 임상 시술자(ML Co-A)가 임상 치료를 담당합니다. 항생제 처방은 사례의 복잡성, 수술적 수술 절차의 어려움 및 소요 시간에 따라 결정됩니다. 따라서 환자는 무작위 배정되지 않고 각 그룹에서 15명의 환자를 얻는 것을 기준으로 합니다. 이것은 개입 연구가 아니며 환자가 예상되는 표준 치료를 받고 있기 때문에 위험 그룹이 없습니다. 타액은 7개의 관찰 시점( 기준선, 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월 및 6개월)에서 수집되고 치은연 플라크 샘플은 4개의 관찰 시점(기준선, 1주, 1개월)에서 수집됩니다. , 삼 개월 ). 발치나 항생제 치료를 받지 않은 15명의 피험자로 구성된 대조군은 정보에 입각한 동의를 얻은 후 모집하고 동일한 7개의 시점에 대해 후속 조치를 취할 것입니다.

피험자는 샘플 수집을 수행하기 전날 밤에 양치질을 자제하고 치과용 구강 세척제를 사용하지 않도록 요청합니다. 수집 시점과는 별개로, 피험자는 연구 기간 동안 '정상적인' 일상적인 구강 위생 절차를 유지하도록 요청받을 것입니다.

타액 샘플 수집을 위한 7가지 시점은 다음과 같습니다.

기준선

1. 주
2. 주
3. 주

1개월 3개월 6개월

플라크 샘플 수집을 위한 세 가지 시점은 다음과 같습니다.

기준 1주

1개월 3개월

기본 샘플 수집 후 세 번째 어금니의 외과 적 발치가 수행됩니다. 피험자는 모든 피험자에게 통증 완화를 위한 추출 후 지침과 진통제를, 항생제가 필요한 환자에게는 아목시실린을 제공할 것입니다. 리콜 약속에서 환자에게 질문하고 아목시실린 정제 포장 스트립을 확인하여 규정 준수 여부를 확인합니다. 대상자는 1개월 연구 기간 동안 구강 세정제 사용을 자제하도록 요청받게 되며(아직 사용하지 않은 경우) 항균 성분이 없는 치약을 사용할 수 있도록 제공됩니다.

각 피험자는 프로빙 깊이, 임상 부착 손실, 치은 지수, 플라크 지수 및 치은 자극의 측정을 포함하는 기본 치주 검사를 받고 구강 건강 상태가 기록됩니다.

DNA 추출을 위한 샘플은 아래에 설명된 대로 지정된 모든 시점에서 수집됩니다. 샘플은 식사 후 적어도 2시간 후에 아침에 채취됩니다. 플라크 및 타액 샘플 수집은 Keijser et al(13)에 의해 설명된 대로 수행됩니다. 샘플은 아침에 채취됩니다. 5ml의 타액은 cryovials(Salimetrics ) 장치에 타액을 수동적으로 흘리도록 피험자에게 요청합니다. 샘플은 즉시 얼음에 넣고 -800C에서 보관합니다. 멸균 마이크로브러시를 사용하여 협측 치아 표면에서 치은연상 플라크 샘플을 수집합니다. 샘플 수집 후 브러시 끝을 절단하여 -800C에서 Eppendorf 튜브 내부에 보관합니다. 치은연 플라그 수집은 6개 치아(16, 11,24,41,36 및 44)에 대해 수행됩니다.

타액 샘플을 볼텍싱하고 0.3ml 용량의 2세트를 0.3g 지르코니아 실리카 비드가 있는 2개의 멸균 2캡 Eppendorf 튜브로 옮깁니다.

50마이크로리터의 타액은 C-반응성 단백질 ELISA 키트(Salimetrics)를 사용하여 기준선 및 1주에서 C-반응성 단백질 수준을 측정하는 데 사용됩니다.

페놀 0.2ml를 첨가하고 미니 비드 비터를 2분 동안 사용하여 샘플을 균질화합니다. DNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 DNA를 추출합니다.

16s r RNA 하이퍼 가변 영역 V4의 증폭은 프라이머를 사용하여 수행되며 시퀀싱은 MiSeq 플랫폼을 사용하여 수행됩니다.

내성 유전자 및 기능적 메타게노믹스에 대한 마이크로어레이는 Card et al(14)에 의해 기술된 바와 같이 수행될 것이다.

피험자의 치료 이것은 수술 후 항생제 유무에 관계없이 사랑니 발치 수술을 받는 젊은 성인을 조사하는 전향적, 종단, 관찰, 코호트 연구입니다. 수술 후 항생제와 진통제를 투여합니다.

아목시실린 경구로, 5일 동안 매일 3회 250mg 진통제 - 3일 동안 Arcoxia 120mg 및 3일 동안 Paracetamol 500mg QID PRN 또는 Paracetamol 1g + 16mg Codeine Phosphate. 항생제의 처방은 사례의 복잡성, 외상 및 시술 기간을 기반으로 한 임상적 판단을 기반으로 합니다. 무작위화는 수행되지 않습니다. 5개의 관찰 시점(기준선, 1주, 2주, 3주 및 1개월)에서 타액을 수집하고 3개의 관찰 시점(기준선, 1주 및 1개월)에서 치은연 플라크 샘플을 수집합니다. 준수 여부를 확인합니다. 리콜 약속에서 환자에게 물어보고 아목시실린의 알약 포장지 스트립을 확인합니다.

효능 평가 연구는 신약의 효능을 조사하지 않습니다. 수행되는 치료 절차는 기존의 치료 프로토콜에 따릅니다.

안전성 평가 연구는 신약의 안전성을 고려하지 않습니다. 수행되는 치료 절차는 기존의 치료 프로토콜에 따릅니다.

통계 분석. http://www.mothur.org/wiki/File에서 Schloss에 의해 기술된 바와 같이 V4 정방향 프라이머 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 및 V4 역방향 프라이머 GGACTACHVGGGTWTCTAAT를 사용하여 샘플 각각에 대해 소형 소단위 리보솜 RNA 유전자 V4 하이퍼 가변 영역의 바코드 앰플리콘 라이브러리가 생성될 것입니다. :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. 앰플리콘 라이브러리는 등몰량으로 풀링되고 Illumina MiSeq 시스템을 통해 시퀀싱됩니다. 시퀀싱 데이터는 QIIME(15) 및 UPARSE(16) 파이프라인의 조합을 사용하여 처리됩니다. 품질 필터링 후 읽기는 UPARSE를 사용하여 97%의 최소 시퀀스 유사성에서 OTU(Operational Taxonomic Units)로 클러스터링됩니다. 각 클러스터의 대표 시퀀스에는 QIIME에 대해 80% 신뢰도로 RDP(Ribosomal Database Project) 분류기를 사용하여 분류법이 지정됩니다.

시퀀싱 깊이의 차이를 정규화하기 위해 읽기는 동일한 수의 읽기/샘플에서 임의로 하위 샘플링됩니다. log2로 변환된 OTU 데이터 및 다양성 통계(Shannon Diversity Index), Bray-Curtis 유사성 지수, 분산의 일원 순열 다변량 분석(PERMANOVA) 및 유사성 백분율(SIMPER)에 대한 주성분 분석(PCA)에 의한 데이터 축소가 수행됩니다. PAST 소프트웨어 사용(17). PCA는 치료 및 방문에 의한 잠재적 미생물 군집 클러스터링을 시각화하는 데 사용됩니다. Shannon Diversity 지수는 분류군(OTU)의 수와 전체 데이터 세트에 대한 각 OTU의 상대적 기여도를 고려합니다. Bray-Curtis 유사성 지수는 0과 1 사이의 범위입니다. 여기서 1은 두 샘플이 동일한 구성을 가지고 있음을 의미하고 0은 두 샘플이 어떤 종도 공유하지 않음을 의미합니다. 이 지수는 방문 1(기준선 샘플)과 동일한 개인의 다른 모든 방문 사이의 미생물 군집의 유사성을 평가하기 위해 적용될 것입니다. 이 방법을 사용하면 미생물의 시간 이동을 정량화할 수 있습니다. 독립적인 샘플 T-테스트를 ​​사용하여 두 치료 그룹 사이의 미생물 군집 이동을 비교합니다. PERMANOVA는 마이크로바이옴 프로필이 두 치료 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 있는지 평가하는 데 사용됩니다. SIMPER는 처리 그룹 간의 차이에 가장 크게 기여하는 OTU를 식별하는 데 사용됩니다.

마이크로바이옴 분석 결과:

각 샘플 유형(플라크 및 타액) 및 각 시점마다 각 OTU에 대한 각각의 분류학적 할당과 함께 샘플당 정규화된 판독 횟수가 있는 OTU 테이블이 포함됩니다. 개별 샘플당 Shannon Diversity Index 및 위에서 언급한 통계 분석. 가중 UniFrac 메트릭을 사용하는 클러스터 분석은 서로 다른 시점에서 박테리아의 상대적 존재비를 분석하는 데 사용됩니다.

소스 데이터/문서에 대한 액세스 임상시험 관련 모니터링, 감사 및 소스 데이터/문서에 대한 IRB 검토를 위해 액세스가 허용됩니다.

품질 관리 및 품질 보증 관리 또는 RA 직원이 데이터를 수집하고 입력하는 데 표준 임상 검사 양식이 사용됩니다. 임상 심사관은 양식을 사용하는 방법과 숙련된 임상의의 입력 및 필요한 경우 보정을 기반으로 임상적 판단을 내리는 방법에 대해 교육을 받습니다. 모든 치아 추출은 동일한 전문 임상의가 수행하고 샘플 수집은 훈련된 임상 검사자가 수행합니다.

윤리 항생제의 처방은 임상의의 판단과 사례의 복잡성을 기반으로 합니다. 이것이 허용되고 일상적인 치료 방식이기 때문에 윤리적 문제는 예상되지 않습니다.

데이터 취급 및 기록 보관 데이터는 데이터 수집 방법을 교육받고 지시를 받은 지정된 임상 검사관이 수집합니다. 행정 직원 및 연구 보조원이 데이터를 입력합니다. 기록의 하드 카피와 소프트 카피는 주 조사관과 다른 한 명의 행정 직원이 보관합니다. 연구팀 외에는 이 데이터에 대한 액세스가 허용되지 않습니다.

금융 및 보험 HKU 치과 학부 (PG 기금)

출판 정책 조사 결과 및 데이터는 국제 피어 리뷰 저널 및 유사한 국제 회의에 출판됩니다.