Impacto do Tratamento e Extração de Antibióticos no Microbioma Bucal

Hipótese Um curso de amoxicilina (250 mg, três vezes ao dia por cinco dias), rotineiramente prescrito como parte do protocolo de tratamento para extrações de terceiros molares causa uma mudança significativa do microbioma oral estável.

As medidas de resultados primários são para avaliar:

1. Abundância relativa de bactérias diferentes em 5 pontos de tempo especificados avaliados por sequenciamento de genes de DNA 16 s r do microbioma oral.
2. Abundância relativa e expressão de genes conhecidos de resistência a antibióticos avaliados por um microarray de genes resistentes conhecidos e metagenômica funcional.

As medidas de resultados secundários são para avaliar:

1. Presença de inflamação na cavidade oral, medindo os níveis de proteína C reativa na saliva em 2 momentos.
2. Sinais e sintomas clínicos antes e durante a primeira semana após o tratamento para monitorar a presença de inflamação e infecção.

Serão recrutados indivíduos agendados para extrações cirúrgicas de rotina que derem consentimento por escrito para fazer parte do estudo. Um operador clínico experiente com treinamento especializado em cirurgia maxilofacial (ML Co-A) será responsável pela realização do tratamento clínico. A prescrição de antibióticos será baseada na complexidade do caso, dificuldade do procedimento cirúrgico operatório e tempo gasto. Portanto, os pacientes não serão randomizados, mas com base na obtenção de 15 pacientes em cada grupo. Este não é um estudo de intervenção e não há grupo de risco, pois os pacientes estão recebendo o padrão de atendimento esperado. A saliva será coletada em sete pontos de tempo observacionais (linha de base, uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, três meses e seis meses) e as amostras de placa supragengival serão coletadas em quatro pontos de tempo observacionais (linha de base, uma semana, um mês , três meses ). Um grupo controle de 15 indivíduos que não foram submetidos a extrações dentárias ou tratamento com antibióticos será recrutado após a obtenção do consentimento informado e será acompanhado pelos mesmos sete pontos de tempo.

Os sujeitos serão solicitados a abster-se de escovar os dentes na noite anterior à coleta de amostras e, da mesma forma, a não usar enxaguatórios bucais. Além dos pontos de tempo de coleta, os indivíduos serão solicitados a manter seus procedimentos de higiene oral de rotina 'normais' durante o estudo.

Sete pontos de tempo para coleta de amostras de saliva são:

Linha de base

1. semana
2. semanas
3. semanas

1 mês 3 meses 6 meses

Três pontos de tempo para coleta de amostras de placa são:

Linha de base 1 semana

1 mês 3 meses

Após a coleta das amostras basais será realizada a extração cirúrgica do terceiro molar. O indivíduo receberá instruções pós-extração e analgésicos para alívio da dor para todos os indivíduos e amoxicilina para aqueles que necessitam de antibióticos. A conformidade será verificada perguntando ao paciente e verificando as tiras da embalagem do comprimido de amoxicilina nas consultas de retorno. O sujeito será solicitado a abster-se de usar qualquer enxaguatório bucal durante o período de estudo de um mês (se ainda não o fez) e um creme dental sem conteúdo antibacteriano será fornecido para uso.

Cada indivíduo será submetido a um exame periodontal inicial, incluindo medidas de profundidade de sondagem, perda de inserção clínica, índice gengival, índice de placa e irritação gengival e seu estado de saúde bucal será registrado.

Amostras para extração de DNA serão coletadas em todos os pontos de tempo especificados, conforme descrito abaixo. As amostras serão coletadas pela manhã, pelo menos duas horas após as refeições. A coleta de amostras de placa e saliva será feita conforme descrito por Keijser et al (13). ) pedindo ao sujeito para salivar passivamente no dispositivo. As amostras serão colocadas em gelo imediatamente e armazenadas a -800C. Um microbrush estéril será usado para coletar amostras de placa supragengival das superfícies dentais bucais. Após a coleta da amostra, a ponta da escova será cortada e armazenada dentro de um tubo Eppendorf a -800C. A coleta de placa supragengival será feita para seis dentes (16, 11,24,41,36 e 44).

Amostras de saliva serão agitadas em vórtex e dois conjuntos de volumes de 0,3 ml serão transferidos para dois tubos Eppendorf estéreis de duas tampas com esferas de sílica de zircônia de 0,3 g.

50 microlitros de saliva serão usados ​​para a medição dos níveis de proteína C - reativa no início e uma semana usando o kit C- Reactive Protein ELISA (Salimetrics).

As amostras serão homogeneizadas adicionando 0,2 ml de fenol e utilizando um minibatedor de esferas por 2 minutos. O DNA será extraído usando um kit de extração de DNA (Qiagen).

A amplificação da região hipervariável do 16s r RNA V4, será feita por primers e o sequenciamento será feito pela plataforma MiSeq.

Microarray para os genes de resistência e metagenômica funcional serão realizados conforme descrito por Card et al (14).

Tratamento de Indivíduos Este é um estudo prospectivo, longitudinal, observacional, de coorte que investiga adultos jovens submetidos à extração cirúrgica de um dente do siso com e sem antibióticos no pós-operatório. Antibióticos e analgésicos serão administrados no pós-operatório.

Amoxicilina via oral três vezes ao dia 250 mg por 5 dias Analgésicos - Arcoxia 120 mg por três dias e Paracetamol 500 mg QID PRN por 3 dias ou Paracetamol 1 g Mais 16 mg Fosfato de Codeína. A prescrição de antibióticos será baseada no julgamento clínico baseado na complexidade do caso, trauma e duração do procedimento. Nenhuma randomização será realizada. A saliva será coletada em cinco pontos de tempo observacionais (linha de base, uma semana, duas semanas, três semanas e um mês) e as amostras de placa supragengival serão coletadas em três pontos de tempo observacionais (linha de base, uma semana e um mês). A conformidade será verificada para perguntar ao paciente e verificar as tiras de embalagem do comprimido de amoxicilina nas consultas de retorno.

Avaliação da eficácia O estudo não está analisando a eficácia de um novo medicamento. Os procedimentos de tratamento que estão sendo realizados estão de acordo com o protocolo de tratamento convencional.

Avaliação da segurança O estudo não visa a segurança de um novo medicamento. Os procedimentos de tratamento que estão sendo realizados estão de acordo com o protocolo de tratamento convencional.

Análise estatística. Bibliotecas de amplicon com código de barras da região hipervariável V4 do gene de RNA ribossômico de subunidade pequena serão geradas para cada uma das amostras usando o primer direto V4 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA e o primer reverso V4 GGACTACHVGGGTWTCTAAT conforme descrito por Schloss em http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. As bibliotecas de amplicons serão agrupadas em quantidades equimolares e sequenciadas por meio do sistema Illumina MiSeq. Os dados de sequenciamento serão processados ​​usando uma combinação de pipelines QIIME (15) e UPARSE (16). Após a filtragem de qualidade, as leituras serão agrupadas em Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs) em uma similaridade de sequência mínima de 97% usando UPARSE. A sequência representativa de cada cluster será atribuída uma taxonomia usando o classificador Ribosomal Database Project (RDP) com 80% de confiança no QIIME.

Para normalizar as diferenças na profundidade de sequenciamento, as leituras serão subamostradas aleatoriamente em um número igual de leituras/amostra. A redução de dados por análise de componentes principais (PCA) em dados de OTU transformados em log2 e as estatísticas de diversidade (Índice de Diversidade de Shannon), Índice de Similaridade de Bray-Curtis, análise de variância multivariada permutacional unidirecional (PERMANOVA) e porcentagem de similaridade (SIMPER) serão realizadas usando o software PAST (17). O PCA será usado para visualizar o potencial agrupamento de microbiomas por tratamento e por visita. O índice de Diversidade de Shannon leva em consideração o número de táxons (OTUs) e a contribuição relativa de cada OTU para todo o conjunto de dados. O Bray-Curtis Similarity Index está limitado entre 0 e 1, onde 1 significa que duas amostras têm a mesma composição e 0 significa que as duas amostras não compartilham nenhuma espécie. Este índice será aplicado para avaliar a similaridade nos microbiomas entre a visita 1 (amostra de linha de base) e todas as outras visitas do mesmo indivíduo. Este método permite quantificar o deslocamento microbiano no tempo. O teste T de amostras independentes será usado para comparar as mudanças do microbioma entre os dois grupos de tratamento. PERMANOVA será usado para avaliar se os perfis do microbioma diferem estatisticamente significativamente entre os dois grupos de tratamento. O SIMPER será utilizado para identificar as OTUs que mais contribuem para as diferenças entre os grupos de tratamento.

Resultado da análise do microbioma:

Para cada tipo de amostra (placa e saliva) e cada ponto de tempo incluirá uma tabela OTU com contagens de leitura normalizadas por amostra com a respectiva atribuição taxonômica para cada OTU; Índice de Diversidade de Shannon por amostra individual e as análises estatísticas mencionadas acima. A análise de agrupamento usando métricas UniFrac ponderadas será usada para analisar a abundância relativa de bactérias em diferentes pontos de tempo.

Acesso aos dados/documentos de origem O acesso será permitido para monitoramento relacionado ao estudo, auditorias e revisão do IRB aos dados/documentos de origem.

Controle de qualidade e garantia de qualidade Um proforma de exame clínico padrão será usado para coletar dados e inseridos pela equipe administrativa ou de AR. Os examinadores clínicos serão treinados para usar o formulário e fazer julgamentos clínicos com base nas informações de médicos experientes e, quando necessário, calibrados. Todas as extrações dentárias serão realizadas pelo mesmo clínico especialista e a coleta de amostras será feita por examinadores clínicos treinados.

Ética A prescrição de antibióticos será baseada no julgamento do médico e na complexidade do caso. Não há questões éticas previstas, uma vez que este é um modo de tratamento aceito e rotineiro.

Manipulação de dados e manutenção de registros Os dados serão coletados por examinadores clínicos designados que serão treinados e instruídos sobre como coletar os dados. A equipe administrativa e os assistentes de pesquisa inserirão os dados. Cópias impressas e eletrônicas dos registros serão mantidas pelo investigador principal e outro funcionário administrativo. Nenhum acesso a esses dados será permitido além da equipe de pesquisa.

Financiamento e Seguros HKU Faculdade de Odontologia (PG Funds)

Política de Publicação Resultados e dados serão publicados em periódicos internacionais revisados ​​por pares e em conferências internacionais similares.