Impacto del tratamiento y la extracción con antibióticos en el microbioma oral

Hipótesis Un curso de amoxicilina (250 mg, tres veces al día durante cinco días), recetado de forma rutinaria como parte del protocolo de tratamiento para las extracciones de terceros molares, provoca un cambio significativo del microbioma oral estable.

Las medidas de resultado primarias son para evaluar:

1. Abundancia relativa de diferentes bacterias en 5 puntos de tiempo específicos evaluados por secuenciación del gen de ADN 16 s r del microbioma oral.
2. Abundancia relativa y expresión de genes de resistencia a antibióticos conocidos evaluados mediante una micromatriz de genes de resistencia conocidos y metagenómica funcional.

Las medidas de resultado secundarias son para evaluar:

1. Presencia de inflamación en la cavidad oral mediante la medición de los niveles de proteína C reactiva en la saliva en 2 puntos temporales.
2. Signos y síntomas clínicos antes y durante la primera semana después del tratamiento para controlar la presencia de inflamación e infección.

Se reclutarán sujetos programados para extracciones quirúrgicas de rutina que den su consentimiento por escrito para ser parte del estudio. Un operador clínico experimentado con formación especializada en cirugía maxilofacial (ML Co-A) será responsable de realizar el tratamiento clínico. La prescripción de antibióticos se basará en la complejidad del caso, la dificultad del procedimiento quirúrgico operatorio y el tiempo necesario. Por lo tanto, los pacientes no serán aleatorizados, sino basados ​​en la obtención de 15 pacientes en cada grupo. Este no es un estudio de intervención y no hay un grupo de riesgo ya que los pacientes reciben el estándar de atención esperado. La saliva se recolectará en siete puntos temporales de observación (Línea base, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses y seis meses) y las muestras de placa supragingival se recolectarán en cuatro puntos temporales de observación (Línea base, una semana, un mes , tres meses ). Se reclutará un grupo de control de 15 sujetos que no se someten a extracciones dentales ni a tratamientos con antibióticos después de obtener el consentimiento informado y se les hará un seguimiento durante los mismos siete puntos de tiempo.

Se les pedirá a los sujetos que se abstengan de cepillarse los dientes la noche anterior a la recolección de muestras y se les pedirá de manera similar que no usen enjuagues bucales dentales. Además de los puntos de tiempo de recolección, se les pedirá a los sujetos que mantengan sus procedimientos de higiene bucal de rutina "normales" durante la duración del estudio.

Los siete puntos de tiempo para la recolección de muestras de saliva son:

Base

1. semana
2. semanas
3. semanas

1 mes 3 meses 6 meses

Los tres puntos de tiempo para la recolección de muestras de placa son:

Línea base 1 semana

1 mes 3 meses

Después de la recolección de las muestras de referencia, se realizará la extracción quirúrgica del tercer molar. El sujeto recibirá instrucciones post extracción y analgésicos para el alivio del dolor para todos los sujetos y amoxicilina para aquellos que requieran antibióticos. El cumplimiento se verificará preguntándole al paciente y revisando las tiras de envoltura de la tableta de amoxicilina en las citas de revisión. Se le pedirá al sujeto que se abstenga de usar cualquier enjuague bucal durante el período de estudio de un mes (si aún no lo ha hecho) y se le proporcionará una pasta de dientes sin contenido antibacteriano para su uso.

Cada sujeto se someterá a un examen periodontal inicial, incluidas las mediciones de las profundidades de sondaje, la pérdida de inserción clínica, el índice gingival, el índice de placa y la irritación gingival, y se registrará su estado de salud bucal.

Las muestras para la extracción de ADN se recolectarán en todos los puntos de tiempo especificados como se describe a continuación. Las muestras se tomarán por la mañana al menos dos horas después de las comidas. La recolección de muestras de placa y saliva se realizará según lo descrito por Keijser et al (13). Las muestras se tomarán por la mañana. Se recolectarán 5 ml de saliva utilizando crioviales (Salimetrics ) pidiéndole al sujeto que babee saliva pasivamente en el dispositivo. Las muestras se colocarán en hielo inmediatamente y se almacenarán a -800C. Se utilizará un microcepillo estéril para recoger muestras de placa supragingival de las superficies dentales bucales. Después de la recolección de muestras, se cortará la punta del cepillo y se almacenará dentro de un tubo Eppendorf a -800C. La recolección de placa supragingival se realizará para seis dientes (16, 11, 24, 41, 36 y 44).

Las muestras de saliva se agitarán en un vórtex y se transferirán dos conjuntos de volúmenes de 0,3 ml a dos tubos Eppendorf estériles de dos tapas con perlas de sílice de zirconio de 0,3 g.

Se utilizarán 50 microlitros de saliva para la medición de los niveles de proteína C-reactiva al inicio y una semana usando el kit ELISA de proteína C-reactiva (Salimetrics).

Las muestras se homogeneizarán añadiendo 0,2 ml de fenol y utilizando un minibatidor de bolas durante 2 minutos. El ADN se extraerá utilizando un kit de extracción de ADN (Qiagen).

La amplificación de la región hipervariable V4 del ARN r 16s se realizará mediante cebadores y la secuenciación se realizará mediante la plataforma MiSeq.

La micromatriz para los genes resistentes y la metagenómica funcional se realizarán como describen Card et al (14).

Tratamiento de los sujetos Este es un estudio de cohorte prospectivo, longitudinal y observacional que investiga a adultos jóvenes que se someten a la extracción quirúrgica de una muela del juicio con y sin antibióticos después de la operación. Se administrarán antibióticos y analgésicos después de la operación.

Amoxicilina Intraoral, tres veces al día 250 mg por 5 días Analgésicos - Arcoxia 120 mg por tres días y Paracetamol 500 mg QID PRN por 3 días o Paracetamol 1 g Más 16 mg de Fosfato de Codeína. La prescripción de antibióticos se basará en el juicio clínico basado en la complejidad del caso, el traumatismo y la duración del procedimiento. No se realizará ninguna aleatorización. La saliva se recolectará en cinco puntos de tiempo de observación (Línea base, una semana, dos semanas, tres semanas y un mes) y las muestras de placa supragingival se recolectarán en tres puntos de tiempo de observación (Línea base, una semana y un mes). Se verificará el cumplimiento preguntando al paciente y revisando las tiras de envoltura de la tableta de amoxicilina en las citas de revisión.

Evaluación de la eficacia El estudio no analiza la eficacia de un nuevo fármaco. Los procedimientos de tratamiento que se llevan a cabo están de acuerdo con el protocolo de tratamiento convencional.

Evaluación de la seguridad El estudio no analiza la seguridad de un nuevo fármaco. Los procedimientos de tratamiento que se llevan a cabo están de acuerdo con el protocolo de tratamiento convencional.

Análisis estadístico. Se generarán bibliotecas de amplicones con código de barras de la región hipervariable V4 del gen del ARN ribosomal de la subunidad pequeña para cada una de las muestras usando el cebador directo V4 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA y el cebador inverso V4 GGACTACHVGGGTWTCTAAT como describe Schloss en http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Las bibliotecas de amplicones se agruparán en cantidades equimolares y se secuenciarán mediante el sistema Illumina MiSeq. Los datos de secuenciación se procesarán mediante una combinación de canalizaciones QIIME (15) y UPARSE (16). Después del filtrado de calidad, las lecturas se agruparán en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud de secuencia mínima del 97 % mediante UPARSE. A la secuencia representativa de cada grupo se le asignará una taxonomía utilizando el clasificador Ribosomal Database Project (RDP) con un 80 % de confianza en QIIME.

Para normalizar las diferencias en la profundidad de secuenciación, las lecturas se submuestrearán aleatoriamente a igual número de lecturas/muestra. Se realizará la reducción de datos mediante análisis de componentes principales (PCA) en datos OTU transformados log2 y las estadísticas de diversidad (Índice de diversidad de Shannon), Índice de similitud de Bray-Curtis, análisis de varianza multivariante permutacional unidireccional (PERMANOVA) y porcentaje de similitud (SIMPER). utilizando el software PAST (17). PCA se utilizará para visualizar el posible agrupamiento de microbiomas por tratamiento y por visita. El índice de diversidad de Shannon tiene en cuenta el número de taxones (OTU) y la contribución relativa de cada OTU al conjunto de datos completo. El índice de similitud de Bray-Curtis está limitado entre 0 y 1, donde 1 significa que dos muestras tienen la misma composición y 0 significa que las dos muestras no comparten ninguna especie. Este índice se aplicará para evaluar la similitud de los microbiomas entre la visita 1 (muestra de referencia) y todas las demás visitas del mismo individuo. Este método permite cuantificar el cambio microbiano en el tiempo. Se utilizará la prueba T de muestras independientes para comparar los cambios en el microbioma entre los dos grupos de tratamiento. PERMANOVA se utilizará para evaluar si los perfiles de microbioma difieren de forma estadísticamente significativa entre los dos grupos de tratamiento. SIMPER se utilizará para identificar las UTO que más contribuyen a las diferencias entre los grupos de tratamiento.

Resultado del análisis del microbioma:

Para cada tipo de muestra (placa y saliva) y cada punto de tiempo se incluirá una tabla de OTU con recuentos de lectura normalizados por muestra con la asignación taxonómica respectiva para cada OTU; Índice de diversidad de Shannon por muestra individual y los análisis estadísticos mencionados anteriormente. Se utilizará el análisis de conglomerados utilizando métricas UniFrac ponderadas para analizar la abundancia relativa de bacterias en diferentes momentos.

Acceso a datos/documentos de origen Se permitirá el acceso a los datos/documentos de origen para el control, las auditorías y la revisión del IRB relacionados con el ensayo.

Control de calidad y garantía de calidad Se utilizará un formulario de examen clínico estándar para recopilar datos y el personal administrativo o de RA lo ingresará. Los examinadores clínicos recibirán capacitación sobre cómo usar el formulario y emitir juicios clínicos basados ​​en los aportes de médicos experimentados y, cuando sea necesario, calibrados. Todas las extracciones dentales serán realizadas por el mismo médico experto y la recolección de muestras la realizarán examinadores clínicos capacitados.

Ética La prescripción de antibióticos se basará en el juicio del médico y la complejidad del caso. No se anticipan problemas éticos ya que este es un modo de tratamiento aceptado y de rutina.

Manejo de datos y mantenimiento de registros Los datos serán recopilados por examinadores clínicos designados que serán capacitados e instruidos sobre cómo recopilar los datos. El personal administrativo y los asistentes de investigación ingresarán los datos. El investigador principal y otro miembro del personal administrativo mantendrán copias impresas y electrónicas de los registros. No se permitirá el acceso a estos datos fuera del equipo de investigación.

Financiamiento y Seguro HKU Facultad de Odontología (Fondos PG)

Política de publicación Los hallazgos y los datos se publicarán en revistas internacionales revisadas por pares y en conferencias internacionales similares.