Indvirkning af antibiotikabehandling og ekstraktion på det orale mikrobiome

Hypotese En kur med amoxicillin (250 mg, tre gange dagligt i fem dage), rutinemæssigt ordineret som en del af behandlingsprotokollen for tredje molære ekstraktioner forårsager en signifikant ændring af det stabile orale mikrobiom.

De primære resultatmål er at vurdere:

1. Relativ overflod af forskellige bakterier på 5 specificerede tidspunkter vurderet ved 16 s r DNA-gensekventering af det orale mikrobiom.
2. Relativ overflod og ekspression af kendte antibiotikaresistensgener vurderet af en mikroarray af kendte resistente gener og funktionel metagenomik.

Sekundære resultatmål er at vurdere:

1. Tilstedeværelse af betændelse i mundhulen ved at måle niveauerne af C-reaktivt protein i spyttet på 2 tidspunkter.
2. Kliniske tegn og symptomer før og i løbet af den første uge efter behandling for at overvåge tilstedeværelsen af ​​betændelse og infektion.

Forsøgspersoner, der er planlagt til rutinemæssige kirurgiske ekstraktioner, og som giver et skriftligt samtykke til at være en del af undersøgelsen, vil blive rekrutteret. En erfaren klinisk operatør med specialist kæbekirurgisk uddannelse (ML Co-A) vil være ansvarlig for at udføre klinisk behandling. Udskrivning af antibiotika vil være baseret på sagens kompleksitet, sværhedsgraden af ​​det operative kirurgiske indgreb og den tid, det tager. Derfor vil patienter ikke blive randomiseret, men baseret på at opnå 15 patienter i hver gruppe. Dette er ikke et interventionsstudie, og der er ingen risikogruppe, da patienterne modtager den forventede standard for pleje. Spyt vil blive opsamlet på syv observationstidspunkter (basislinje, en uge, to uger, tre uger, en måned, tre måneder og seks måneder), og supragingival plakprøver vil blive indsamlet på fire observationstidspunkter (baseline, en uge, en måned , tre måneder ). En kontrolgruppe på 15 forsøgspersoner, der ikke gennemgår tandudtrækninger eller antibiotikabehandling, vil blive rekrutteret efter indhentet informeret samtykke og vil blive fulgt op i de samme syv tidspunkter.

Forsøgspersonerne vil blive bedt om at undlade at børste tænder aftenen før prøvetagningen skal udføres og på samme måde bedt om ikke at bruge tandmundskyllevand. Ud over indsamlingstidspunkter vil forsøgspersoner blive bedt om at opretholde deres 'normale' rutinemæssige mundhygiejneprocedurer i hele undersøgelsens varighed.

Syv tidspunkter for indsamling af spytprøver er:

Baseline

1. uge
2. uger
3. uger

1 måned 3 måneder 6 måneder

Tre tidspunkter for indsamling af plakprøver er:

Baseline 1 uge

1 måned 3 måneder

Efter indsamling af basislinjeprøverne vil den kirurgiske ekstraktion af den tredje kindtand blive udført. Forsøgspersonen vil få instruktioner efter ekstraktion og analgetika til smertelindring for alle forsøgspersoner og amoxicillin til dem, der har brug for antibiotika. Overholdelse vil blive kontrolleret ved at spørge patienten og kontrollere tabletindpakningsstrimlerne af amoxicillin ved tilbagekaldelsesaftaler. Forsøgspersonen vil blive bedt om at afstå fra at bruge nogen form for mundskylning i løbet af undersøgelsesperioden på en måned (hvis de ikke allerede har gjort det), og en tandpasta uden antibakterielt indhold vil blive leveret til brug.

Hvert individ vil gennemgå en baseline parodontal undersøgelse, inklusive målinger af sonderingsdybder, klinisk tilknytningstab, tandkødsindeks, plakindeks og tandkødsirritation, og deres orale sundhedsstatus vil blive registreret.

Prøver til DNA-ekstraktion vil blive indsamlet på alle de specificerede tidspunkter som beskrevet nedenfor. Prøver vil blive taget om morgenen mindst to timer efter måltider. Indsamling af plak- og spytprøver vil blive udført som beskrevet af Keijser et al (13). Prøver vil blive taget om morgenen. 5 ml spyt vil blive opsamlet ved hjælp af kryovials (Salimetrics). ) ved at bede forsøgspersonen om passivt at savle spyt ind i enheden. Prøver anbringes straks i is og opbevares ved -800°C. En steril mikrobørste vil blive brugt til at indsamle supragingivale plakprøver fra de bukkale dentale overflader. Efter prøveudtagning vil spidsen af ​​børsten blive skåret over og opbevaret inde i et Eppendorf-rør ved -800C. Supragingival plakopsamlingen vil blive udført for seks tænder (16, 11, 24, 41, 36 og 44).

Spytprøver vil blive vortexet, og to sæt på 0,3 ml volumener vil blive overført til to sterile Eppendorf-rør med to hætter med 0,3 g zirconia silica perler.

50 mikroliter spyt vil blive brugt til måling af C - reaktivt protein niveauer ved baseline og en uge ved hjælp af C- Reactive Protein ELISA kit (Salimetrics).

Prøverne homogeniseres ved at tilsætte 0,2 ml phenol og bruge en miniperlepisker i 2 minutter. DNA vil blive ekstraheret ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt (Qiagen).

Amplifikation af 16s r RNA hyper variable region V4 vil blive udført ved hjælp af primere, og sekventeringen vil blive udført ved hjælp af MiSeq platform.

Mikroarray for de resistente gener og funktionel metagenomik vil blive udført som beskrevet af Card et al (14).

Behandling af forsøgspersoner Dette er en prospektiv, longitudinel, observationel kohorteundersøgelse, der undersøger unge voksne, der gennemgår kirurgisk ekstraktion af en visdomstand med og uden antibiotika postoperativt. Antibiotika og analgetika vil blive givet postoperativt.

Amoxicillin Intra oralt, tre gange dagligt 250 mg i 5 dage Analgetika - Arcoxia 120mg i tre dage og Paracetamol 500 mg QID PRN i 3 dage eller Paracetamol 1 g Plus 16 mg kodeinfosfat. Udskrivning af antibiotika vil være baseret på klinisk vurdering baseret på sagens kompleksitet, traumer og procedurens længde. Der vil ikke blive udført randomisering. Spyt vil blive indsamlet på fem observationstidspunkter (basislinje, en uge, to uger, tre uger og en måned), og supragingival plakprøver vil blive indsamlet på tre observationstidspunkter (basislinje, en uge og en måned). Overholdelsen vil blive kontrolleret for ved at spørge patienten og tjekke tabletindpakningsstrimlerne af amoxicillin ved tilbagekaldelsesaftalerne.

Vurdering af effektivitet Undersøgelsen ser ikke på effektiviteten af ​​et nyt lægemiddel. Behandlingsprocedurerne, der udføres, er i overensstemmelse med den konventionelle behandlingsprotokol.

Vurdering af sikkerhed Undersøgelsen ser ikke på sikkerheden ved et nyt lægemiddel. Behandlingsprocedurerne, der udføres, er i overensstemmelse med den konventionelle behandlingsprotokol.

Statistisk analyse. Stregkodede amplikonbiblioteker af den lille underenhed ribosomale RNA-gen V4 hypervariable region vil blive genereret for hver af prøverne ved hjælp af V4 forward primer GTGCCAGCMGCCGCGGTAA og V4 reverse primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT som beskrevet af Schloss i http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Amplikonbibliotekerne vil blive samlet i ækvimolære mængder og sekventeret ved hjælp af Illumina MiSeq-system. Sekvenseringsdataene vil blive behandlet ved hjælp af en kombination af QIIME (15) og UPARSE (16) pipelines. Efter kvalitetsfiltrering vil aflæsningerne blive grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) med en minimal sekvenslighed på 97 % ved brug af UPARSE. Den repræsentative sekvens af hver klynge vil blive tildelt en taksonomi ved hjælp af Ribosomal Database Project (RDP) klassifikatoren med 80 % tillid til QIIME.

For at normalisere for forskelle i sekventeringsdybde, vil læsningerne blive tilfældigt subsamplet ved lige mange læsninger/stikprøver. Datareduktion ved principal komponentanalyse (PCA) på log2 transformerede OTU-data og diversitetsstatistikken (Shannon Diversity Index), Bray-Curtis Similarity Index, envejs permutationel multivariat variansanalyse (PERMANOVA) og lighedsprocent (SIMPER) vil blive udført. ved hjælp af PAST-software (17). PCA vil blive brugt til at visualisere den potentielle mikrobiom-klyngning ved behandling og ved besøg. Shannon Diversity-indekset tager højde for antallet af taxa (OTU'er) og det relative bidrag fra hver OTU til hele datasættet. Bray-Curtis Similarity Index er bundet mellem 0 og 1, hvor 1 betyder, at to prøver har samme sammensætning, og 0 betyder, at de to prøver ikke deler nogen art. Dette indeks vil blive anvendt til at vurdere ligheden i mikrobiomer mellem besøg 1 (basislinjeprøve) og alle andre besøg fra samme person. Denne metode gør det muligt at kvantificere mikrobielt skift i tid. Uafhængige prøver T-test vil blive brugt til at sammenligne mikrobiomskift mellem de to behandlingsgrupper. PERMANOVA vil blive brugt til at vurdere, om mikrobiomprofilerne adskiller sig statistisk signifikant mellem de to behandlingsgrupper. SIMPER vil blive brugt til at identificere de OTU'er, der bidrager mest til forskellene mellem behandlingsgrupperne.

Mikrobiom analyse output:

For hver prøvetype (plak og spyt) og hvert tidspunkt vil inkludere en OTU-tabel med normaliserede aflæsningstællinger pr. prøve med den respektive taksonomiske tildeling for hver OTU; Shannon Diversity Index pr. individuel prøve og de statistiske analyser nævnt ovenfor. Klyngeanalyse ved hjælp af vægtede UniFrac-metrikker vil blive brugt til at analysere den relative overflod af bakterier på forskellige tidspunkter.

Adgang til kildedata/dokumenter Adgang vil være tilladt til forsøgsrelateret overvågning, revisioner og IRB-gennemgang til kildedata/dokumenter.

Kvalitetskontrol og kvalitetssikring En standard klinisk undersøgelsesproforma vil blive brugt til at indsamle data og indtastet af administrativt personale eller RA-personale. Kliniske eksaminatorer vil blive trænet i at bruge formularen og foretage kliniske vurderinger baseret på input fra erfarne klinikere og om nødvendigt kalibreret. Alle tandudtrækninger vil blive udført af den samme ekspert kliniker, og prøveindsamlingen vil blive udført af uddannede kliniske undersøgere.

Etik Udskrivning af antibiotika vil være baseret på klinikerens vurdering og sagskompleksitet. Der forventes ingen etiske problemer, da dette er en accepteret og rutinemæssig behandlingsform.

Datahåndtering og journalføring Data vil blive indsamlet af udpegede kliniske undersøgere, som vil blive trænet og instrueret i, hvordan man indsamler dataene. Administrativt personale og forskningsassistenter vil indtaste dataene. Papir- og bløde kopier af optegnelser vil blive opbevaret af hovedefterforskeren og en anden administrativ medarbejder. Ingen adgang til disse data vil være tilladt bortset fra forskerholdet.

Finansiering og forsikring HKU Det Odontologiske Fakultet (PG-fonde)

Publikationspolitik Resultater og data vil blive offentliggjort i internationale peer reviewede tidsskrifter og på lignende internationale konferencer.