Antibioottihoidon ja -uuton vaikutus suun mikrobiomiin

Hypoteesi Amoksisilliinikuori (250 mg, kolme kertaa päivässä viiden päivän ajan), jota määrätään rutiininomaisesti osana hoitoprotokollaa kolmannen poskiuuton hoitoon, aiheuttaa merkittävän muutoksen stabiilissa suun mikrobiomissa.

Ensisijaisia ​​tulosmittauksia ovat arvioida:

1. Eri bakteerien suhteellinen runsaus 5 määrätyllä aikapisteellä mitattuna suun mikrobiomin 16 sr DNA -geenisekvensoinnilla.
2. Tunnettujen antibioottiresistenssigeenien suhteellinen runsaus ja ilmentyminen mitattuna tunnettujen resistenttien geenien mikrosirulla ja toiminnallisella metagenomiikalla.

Toissijaisilla tulosmittauksilla arvioidaan:

1. Tulehduksen esiintyminen suuontelossa mittaamalla C-reaktiivisen proteiinin tasot syljestä 2 ajankohdassa.
2. Kliiniset merkit ja oireet ennen hoitoa ja ensimmäisen viikon aikana hoidon jälkeen tulehduksen ja infektion seuraamiseksi.

Rekrytoidaan rutiininomaiseen kirurgiseen poistoon varatut koehenkilöt, jotka antavat kirjallisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen. Kliinisen hoidon suorittamisesta vastaa kokenut kliininen operaattori, jolla on erikoislääkärin koulutus (ML Co-A). Antibioottien määrääminen perustuu tapauksen monimutkaisuuteen, operatiivisen kirurgisen toimenpiteen vaikeuteen ja siihen kuluvaan aikaan. Siksi potilaita ei satunnaisteta, vaan se perustuu 15 potilaaseen jokaiseen ryhmään. Tämä ei ole interventiotutkimus, eikä siinä ole riskiryhmää, koska potilaat saavat odotettua hoitotasoa. Sylkeä kerätään seitsemässä havaintoajankohdassa (perustaso, yksi viikko, kaksi viikkoa, kolme viikkoa, yksi kuukausi, kolme kuukautta ja kuusi kuukautta) ja supragingivaaliset plakkinäytteet kerätään neljänä havaintoajankohtana (perustaso, yksi viikko, yksi kuukausi , kolme kuukautta ). Verrokkiryhmä, jossa on 15 henkilöä, joille ei tehdä hampaiden poistoa tai antibioottihoitoa, rekrytoidaan saatuaan tietoisen suostumuksen, ja heitä seurataan samojen seitsemän ajankohdan ajan.

Koehenkilöitä pyydetään pidättäytymään hampaiden harjauksesta näytteenottoa edeltävänä iltana ja vastaavasti pyydetään olemaan käyttämättä hammassuuvettä. Keräysaikoja lukuun ottamatta koehenkilöitä pyydetään säilyttämään "normaalit" rutiininomaiset suuhygieniatoimenpiteensä tutkimuksen ajan.

Seitsemän aikapistettä sylkinäytteiden keräämiselle ovat:

Perustaso

1. viikko
2. viikkoa
3. viikkoa

1 kuukausi 3 kuukautta 6 kuukautta

Kolme aikapistettä plakkinäytteiden keräämiselle ovat:

Perustaso 1 viikko

1 kuukausi 3 kuukautta

Perusviivanäytteiden keräämisen jälkeen suoritetaan kolmannen poskihampaan kirurginen poisto. Koehenkilölle annetaan uuton jälkeen ohjeet ja kipulääkkeet kivunlievitykseen kaikille koehenkilöille ja amoksisilliinia antibiootteja tarvitseville. Vaatimustenmukaisuus tarkistetaan kysymällä potilaalta ja tarkistamalla amoksisilliinitabletin kääreet takaisinkutsuilla. Tutkittavaa pyydetään pidättäytymään minkäänlaisesta suuhuuhtelusta kuukauden tutkimusjakson aikana (jos hän ei ole jo tehnyt niin), ja käyttöön tarjotaan hammastahna, joka ei sisällä antibakteerista sisältöä.

Jokaiselle koehenkilölle tehdään periodontaalinen perustutkimus, joka sisältää mittaukset koetussyvyydestä, kliinisen kiinnittymisen katoamisesta, ienindeksistä, plakkiindeksistä ja ienärsytystä, ja heidän suun terveydentilansa kirjataan.

Näytteet DNA-uuttoa varten kerätään kaikkina määrättyinä ajankohtina alla kuvatulla tavalla. Näytteet otetaan aamulla vähintään kaksi tuntia ruokailun jälkeen. Plakki- ja sylkinäytteet otetaan Keijser et al. (13) mukaisesti. Näytteet otetaan aamulla. 5 ml sylkeä kerätään kryovialilla (Salimetrics). ) pyytämällä kohdetta kuolaamaan passiivisesti sylkeä laitteeseen. Näytteet laitetaan välittömästi jäihin ja säilytetään -800C:ssa. Supragingival plakkinäytteiden keräämiseen posken hampaiden pinnoilta käytetään steriiliä mikroharjaa. Näytteenoton jälkeen harjan kärki leikataan ja säilytetään Eppendorf-putken sisällä -800 C:ssa. Supragingival plakin keräys tehdään kuudelle hampaalle (16, 11, 24, 41, 36 ja 44).

Sylkinäytteet vorteksoidaan ja kaksi 0,3 ml:n tilavuussarjaa siirretään kahteen steriiliin kaksikorkkiseen Eppendorf-putkeen, joissa on 0,3 g zirkoniumoksidipiidioksidihelmiä.

50 mikrolitraa sylkeä käytetään C-reaktiivisen proteiinin pitoisuuksien mittaamiseen lähtötilanteessa ja yhden viikon ajan käyttämällä C-Reactive Protein ELISA -kittiä (Salimetrics).

Näytteet homogenoidaan lisäämällä 0,2 ml fenolia ja käyttämällä minihelmisekoitinta 2 minuutin ajan. DNA uutetaan käyttämällä DNA-uuttopakkausta (Qiagen).

16sr RNA:n hypervariaabelin alueen V4 monistaminen suoritetaan käyttämällä alukkeita ja sekvensointi suoritetaan MiSeq-alustaa käyttäen.

Resistenttien geenien mikrosiru ja toiminnallinen metagenomiikka suoritetaan Card et ai:n (14) kuvaamalla tavalla.

Koehenkilöiden hoito Tämä on prospektiivinen, pitkittäinen, havainnollinen, kohorttitutkimus, jossa tutkitaan nuoria aikuisia, joille tehdään kirurginen viisaudenhampaan poisto antibioottien kanssa ja ilman antibiootteja leikkauksen jälkeen. Leikkauksen jälkeen annetaan antibiootteja ja kipulääkkeitä.

Amoksisilliini Suun kautta, kolme kertaa päivässä 250 mg 5 päivän ajan Kipulääkkeet - Arcoxia 120 mg kolmen päivän ajan ja Parasetamoli 500 mg QID PRN 3 päivän ajan tai Parasetamoli 1 g Plus 16 mg kodeiinifosfaattia. Antibioottien määrääminen perustuu kliiniseen arvioon, joka perustuu tapauksen monimutkaisuuteen, traumaan ja toimenpiteen pituuteen. Satunnaistamista ei tehdä. Sylkeä kerätään viidessä havaintoajankohdassa (perustaso, yksi viikko, kaksi viikkoa, kolme viikkoa ja yksi kuukausi) ja supragingival-plakkinäytteet otetaan kolmessa havaintoajankohdassa (perustaso, yksi viikko ja yksi kuukausi). Vaatimustenmukaisuus tarkastetaan. kysymällä potilaalta ja tarkistamalla amoksisilliinia sisältävän tabletin kääreliuskat palautuskäynneillä.

Arvio tehokkuudesta Tutkimuksessa ei tarkastella uuden lääkkeen tehoa. Suoritettavat hoitotoimenpiteet ovat tavanomaisen hoitoprotokollan mukaisia.

Turvallisuuden arviointi Tutkimuksessa ei tarkastella uuden lääkkeen turvallisuutta. Suoritettavat hoitotoimenpiteet ovat tavanomaisen hoitoprotokollan mukaisia.

Tilastollinen analyysi. Pienen alayksikön ribosomaalisen RNA-geenin V4 hypervariaabelialueen viivakoodatut amplikonikirjastot luodaan kullekin näytteelle käyttämällä eteenpäin suuntautuvaa V4-aluketta GTGCCAGCMGCCGCGGTAA ja V4-käänteisaluketta GGACTACHVGGGTWTCTAAT, kuten Schloss on kuvannut osoitteessa http://www.mothur.org/wiki :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Amplikonikirjastot yhdistetään ekvimolaarisina määrinä ja sekvensoidaan Illumina MiSeq -järjestelmän avulla. Sekvensointitiedot käsitellään käyttämällä QIIME (15) ja UPARSE (16) liukuhihnan yhdistelmää. Laatusuodatuksen jälkeen lukemat klusteroidaan operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) 97 %:n vähimmäissekvenssin samankaltaisuuteen UPARSEa käyttämällä. Kunkin klusterin edustavalle sekvenssille määritetään taksonomia käyttämällä Ribosomal Database Project (RDP) -luokitinta 80 %:n varmuudella QIIME:ssä.

Sekvensointisyvyyden erojen normalisoimiseksi lukemat alinäytteitetään satunnaisesti yhtä suurella määrällä lukuja/näyte. Tietojen vähentäminen pääkomponenttianalyysillä (PCA) log2-muunnetuille OTU-tiedoille ja monimuotoisuustilastoihin (Shannon Diversity Index), Bray-Curtisin samankaltaisuusindeksiin, yksisuuntaiseen permutaatioon monimuuttujavarianssianalyysiin (PERMANOVA) ja samankaltaisuusprosenttiin (SIMPER) käyttämällä PAST-ohjelmistoa (17). PCA:ta käytetään mahdollisen mikrobiomiklusteroinnin visualisoimiseen hoidon ja käynnin perusteella. Shannon Diversity -indeksi ottaa huomioon taksonien määrän (OTU:t) ja kunkin OTU:n suhteellisen osuuden koko aineistosta. Bray-Curtisin samankaltaisuusindeksi on sidottu 0:n ja 1:n välille, missä 1 tarkoittaa, että kahdella näytteellä on sama koostumus ja 0 tarkoittaa, että kahdella näytteellä ei ole samaa lajia. Tätä indeksiä käytetään arvioimaan mikrobiomien samankaltaisuutta käynnin 1 (perusnäyte) ja kaikkien muiden saman henkilön käyntien välillä. Tämä menetelmä mahdollistaa mikrobien ajallisen siirtymän kvantifioinnin. Riippumattomien näytteiden T-testiä käytetään vertaamaan mikrobiomimuutoksia kahden hoitoryhmän välillä. PERMANOVAa käytetään arvioimaan, eroavatko mikrobiomiprofiilit tilastollisesti merkitsevästi kahden hoitoryhmän välillä. SIMPERiä käytetään tunnistamaan ne OTU:t, jotka vaikuttavat eniten hoitoryhmien välisiin eroihin.

Mikrobiomianalyysin tulos:

Kutakin näytetyyppiä (plakki ja sylki) ja jokaista aikapistettä kohti sisältää OTU-taulukon, jossa on normalisoidut lukumäärät näytettä kohti ja kunkin OTU:n vastaava taksonominen määritys; Shannonin monimuotoisuusindeksi yksittäistä otosta kohti ja edellä mainitut tilastolliset analyysit. Klusterianalyysiä käyttäen painotettuja UniFrac-mittareita käytetään analysoimaan bakteerien suhteellista runsautta eri ajankohtina.

Pääsy lähdetietoihin/asiakirjoihin Pääsy sallitaan kokeisiin liittyvää seurantaa, tarkastuksia ja lähdetietojen/asiakirjojen IRB-tarkastuksia varten.

Laadunvalvonta ja laadunvarmistus Tietojen keräämiseen käytetään vakiomuotoista kliinisen tutkimuksen esikuvaa, jonka hallinto- tai RA-henkilöstö syöttää. Kliiniset tutkijat koulutetaan käyttämään lomaketta ja tekemään kliinisiä arvioita kokeneiden kliinikkojen syötteiden perusteella ja tarvittaessa kalibroituja. Kaikki hampaiden poistot suorittaa sama asiantunteva kliinikko ja näytteenoton suorittavat koulutetut kliiniset tutkijat.

Etiikka Antibioottien määrääminen perustuu kliinikon harkintaan ja tapauksen monimutkaisuuteen. Eettisiä ongelmia ei odoteta, koska tämä on hyväksytty ja rutiinihoitomuoto.

Tietojen käsittely ja tallentaminen Tiedot keräävät nimetyt kliiniset tutkijat, jotka koulutetaan ja opastetaan tietojen keräämiseen. Hallintohenkilöstö ja tutkimusassistentit syöttävät tiedot. Päätutkija ja yksi muu hallintohenkilö säilyttää asiakirjan paperikopiot ja pehmeät kopiot. Näihin tietoihin ei sallita pääsyä lukuun ottamatta tutkimusryhmää.

Rahoitus ja vakuutus HKU Hammaslääketieteellinen tiedekunta (PG-rahastot)

Julkaisupolitiikka Havainnot ja tiedot julkaistaan ​​kansainvälisissä vertaisarvioiduissa julkaisuissa ja vastaavissa kansainvälisissä konferensseissa.