Impatto del trattamento antibiotico e dell'estrazione sul microbioma orale

Ipotesi Un ciclo di amoxicillina (250 mg, tre volte al giorno per cinque giorni), regolarmente prescritto come parte del protocollo di trattamento per le estrazioni del terzo molare, provoca un cambiamento significativo del microbioma orale stabile.

Le misure di esito primarie devono valutare:

1. Abbondanza relativa di diversi batteri in 5 punti temporali specificati valutati dal sequenziamento genico del DNA di 16 s r del microbioma orale.
2. Abbondanza relativa ed espressione di geni di resistenza agli antibiotici noti valutati da un microarray di geni resistenti noti e metagenomica funzionale.

Le misure di esito secondarie devono valutare:

1. Presenza di infiammazione nel cavo orale misurando i livelli di proteina C-reattiva nella saliva in 2 punti temporali.
2. Segni e sintomi clinici prima e durante la prima settimana dopo il trattamento per monitorare la presenza di infiammazione e infezione.

Verranno reclutati soggetti programmati per estrazioni chirurgiche di routine che danno un consenso scritto a far parte dello studio. Un operatore clinico esperto con formazione specialistica in chirurgia maxillofacciale (ML Co-A) sarà responsabile dell'esecuzione del trattamento clinico. La prescrizione di antibiotici sarà basata sulla complessità del caso, sulla difficoltà della procedura chirurgica operativa e sul tempo impiegato. Pertanto i pazienti non saranno randomizzati ma basati sull'ottenimento di 15 pazienti in ciascun gruppo. Questo non è uno studio di intervento e non esiste un gruppo a rischio poiché i pazienti ricevono lo standard di cura previsto. La saliva sarà raccolta in sette punti temporali di osservazione (baseline, una settimana, due settimane, tre settimane, un mese, tre mesi e sei mesi) e i campioni di placca sopragengivale saranno raccolti in quattro punti temporali di osservazione (baseline, una settimana, un mese , tre mesi ). Un gruppo di controllo di 15 soggetti che non subiranno estrazioni dentarie o trattamento antibiotico sarà reclutato dopo aver ottenuto il consenso informato e sarà seguito per gli stessi sette punti temporali.

Ai soggetti verrà chiesto di astenersi dal lavarsi i denti la notte prima che venga eseguita la raccolta del campione e allo stesso modo verrà chiesto di non usare collutori dentali. A parte i tempi di raccolta, ai soggetti verrà chiesto di mantenere le loro "normali" procedure di igiene orale di routine per tutta la durata dello studio.

Sette punti temporali per la raccolta di campioni di saliva sono:

Linea di base

1. settimana
2. settimane
3. settimane

1 mese 3 mesi 6 mesi

Tre punti temporali per la raccolta di campioni di placca sono:

Linea di base 1 settimana

1 mese 3 mesi

Dopo la raccolta dei campioni basali verrà eseguita l'estrazione chirurgica del terzo dente molare. Al soggetto verranno fornite istruzioni post-estrazione e analgesici per alleviare il dolore per tutti i soggetti e amoxicillina per coloro che richiedono antibiotici. La conformità sarà verificata chiedendo al paziente e controllando le strisce di involucro della compressa di amoxicillina agli appuntamenti di richiamo. Al soggetto verrà chiesto di astenersi dall'utilizzare qualsiasi collutorio durante il periodo di studio di un mese (se non lo ha già fatto) e verrà fornito un dentifricio senza contenuto antibatterico per l'uso.

Ogni soggetto verrà sottoposto a un esame parodontale di base, comprese le misurazioni delle profondità di sondaggio, perdita di attacco clinico, indice gengivale, indice di placca e irritazione gengivale e verrà registrato il loro stato di salute orale.

I campioni per l'estrazione del DNA verranno raccolti in tutti i punti temporali specificati come descritto di seguito. I campioni saranno prelevati al mattino almeno due ore dopo i pasti La raccolta dei campioni di placca e saliva sarà effettuata come descritto da Keijser et al (13). I campioni saranno prelevati al mattino 5 ml di saliva saranno raccolti utilizzando crioviali (Salimetrics ) chiedendo al soggetto di sbavare passivamente nel dispositivo. I campioni saranno posti immediatamente in ghiaccio e conservati a -80°C. Verrà utilizzato un microbrush sterile per raccogliere campioni di placca sopragengivale dalle superfici dentali buccali. Dopo la raccolta del campione, la punta dello spazzolino verrà tagliata e conservata all'interno di una provetta Eppendorf a -80°C. La raccolta della placca sopragengivale verrà eseguita per sei denti (16, 11,24,41,36 e 44).

I campioni di saliva saranno sottoposti a vortex e due set di volumi da 0,3 ml saranno trasferiti in due provette Eppendorf sterili a due tappi con biglie di silice di zirconio da 0,3 g.

50 microlitri di saliva verranno utilizzati per la misurazione dei livelli di proteina C-reattiva al basale e una settimana utilizzando il kit ELISA per la proteina C-reattiva (Salimetrics).

I campioni saranno omogeneizzati aggiungendo 0.2 ml di fenolo e usando un mini bead beater per 2 minuti. Il DNA verrà estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA (Qiagen).

L'amplificazione della regione ipervariabile V4 dell'RNA 16s r sarà effettuata utilizzando primer e il sequenziamento verrà eseguito utilizzando la piattaforma MiSeq.

Microarray per i geni resistenti e metagenomica funzionale saranno eseguiti come descritto da Card et al (14).

Trattamento dei soggetti Questo è uno studio prospettico, longitudinale, osservazionale, di coorte che indaga su giovani adulti sottoposti a estrazione chirurgica di un dente del giudizio con e senza antibiotici nel post-operatorio. Gli antibiotici e gli analgesici saranno somministrati dopo l'intervento.

Amoxicillina Per via orale, tre volte al giorno 250 mg per 5 giorni Analgesici - Arcoxia 120 mg per tre giorni e Paracetamolo 500 mg QID PRN per 3 giorni o Paracetamolo 1 g Plus 16 mg Codeina Fosfato. La prescrizione di antibiotici si baserà sul giudizio clinico basato sulla complessità del caso, sul trauma e sulla durata della procedura. Non verrà eseguita alcuna randomizzazione. La saliva sarà raccolta in cinque punti temporali di osservazione (baseline, una settimana, due settimane, tre settimane e un mese) e i campioni di placca sopragengivale saranno raccolti in tre punti temporali di osservazione (baseline, una settimana e un mese). Verrà verificata la conformità per chiedendo al paziente e controllando le strisce di involucro della compressa di amoxicillina agli appuntamenti di richiamo.

Valutazione dell'efficacia Lo studio non esamina l'efficacia di un nuovo farmaco. Le procedure di trattamento in corso sono secondo il protocollo di trattamento convenzionale.

Valutazione della sicurezza Lo studio non esamina la sicurezza di un nuovo farmaco. Le procedure di trattamento in corso sono secondo il protocollo di trattamento convenzionale.

Analisi statistica. Le librerie di ampliconi con codice a barre della regione iper variabile V4 del gene dell'RNA ribosomiale della subunità piccola saranno generate per ciascuno dei campioni utilizzando il primer V4 forward GTGCCAGCMGCCGCGGTAA e il primer V4 reverse GGACTACHVGGGTWTCTAAT come descritto da Schloss in http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Le librerie di ampliconi saranno raggruppate in quantità equimolari e sequenziate mediante il sistema Illumina MiSeq. I dati di sequenziamento verranno elaborati utilizzando una combinazione di pipeline QIIME (15) e UPARSE (16). Dopo il filtraggio della qualità, le letture verranno raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) con una somiglianza di sequenza minima del 97% utilizzando UPARSE. Alla sequenza rappresentativa di ciascun cluster verrà assegnata una tassonomia utilizzando il classificatore Ribosomal Database Project (RDP) con l'80% di confidenza in QIIME.

Per normalizzare le differenze nella profondità di sequenziamento, le letture verranno sottocampionate in modo casuale a un numero uguale di letture/campione. Verranno eseguite la riduzione dei dati mediante analisi delle componenti principali (PCA) sui dati OTU trasformati in log2 e le statistiche sulla diversità (Shannon Diversity Index), l'indice di somiglianza di Bray-Curtis, l'analisi della varianza multivariata permutazionale unidirezionale (PERMANOVA) e la percentuale di somiglianza (SIMPER) utilizzando il software PAST (17). La PCA verrà utilizzata per visualizzare il potenziale clustering del microbioma per trattamento e per visita. L'indice Shannon Diversity tiene conto del numero di taxa (OTU) e del contributo relativo di ciascuna OTU all'intero set di dati. L'indice di somiglianza di Bray-Curtis è compreso tra 0 e 1, dove 1 significa che due campioni hanno la stessa composizione e 0 significa che i due campioni non condividono alcuna specie. Questo indice verrà applicato per valutare la somiglianza nei microbiomi tra la visita 1 (campione di riferimento) e tutte le altre visite dello stesso individuo. Questo metodo consente di quantificare lo spostamento microbico nel tempo. Campioni indipendenti Il T-test verrà utilizzato per confrontare gli spostamenti del microbioma tra i due gruppi di trattamento. PERMANOVA verrà utilizzato per valutare se i profili del microbioma differiscono in modo statisticamente significativo tra i due gruppi di trattamento. SIMPER verrà utilizzato per identificare le OTU che contribuiscono maggiormente alle differenze tra i gruppi di trattamento.

Risultati dell'analisi del microbioma:

Per ogni tipo di campione (placca e saliva) e ogni punto temporale includerà una tabella OTU con conteggi di lettura normalizzati per campione con la rispettiva assegnazione tassonomica per ogni OTU; Shannon Diversity Index per singolo campione e le analisi statistiche sopra citate. L'analisi dei cluster utilizzando metriche UniFrac ponderate verrà utilizzata per analizzare l'abbondanza relativa di batteri in diversi punti temporali.

Accesso ai dati/documenti di origine L'accesso sarà consentito per il monitoraggio, gli audit e la revisione dell'IRB relativi ai dati/documenti di origine.

Controllo di qualità e garanzia di qualità Per raccogliere i dati verrà utilizzato un proforma standard dell'esame clinico e inserito dal personale amministrativo o RA. Gli esaminatori clinici saranno formati su come utilizzare il modulo e formulare giudizi clinici sulla base del contributo di medici esperti e, se necessario, calibrati. Tutte le estrazioni dentarie saranno eseguite dallo stesso medico esperto e la raccolta dei campioni sarà effettuata da esaminatori clinici qualificati.

Etica La prescrizione di antibiotici si baserà sul giudizio del medico e sulla complessità del caso. Non sono previsti problemi etici poiché si tratta di una modalità di trattamento accettata e di routine.

Gestione dei dati e archiviazione dei dati I dati saranno raccolti da esaminatori clinici designati che saranno addestrati e istruiti su come raccogliere i dati. Il personale amministrativo e gli assistenti alla ricerca inseriranno i dati. Copie cartacee e elettroniche dei registri saranno conservate dall'investigatore principale e da un altro personale amministrativo. Nessun accesso a questi dati sarà consentito al di fuori del gruppo di ricerca.

Finanziamento e Assicurazione Facoltà di Odontoiatria HKU (Fondi PG)

Politica di pubblicazione I risultati ei dati saranno pubblicati su riviste internazionali peer reviewed e in simili conferenze internazionali.