抗生素处理和提取对口腔微生物群落的影响

假设 一个疗程的阿莫西林（250 毫克，每天 3 次，持续 5 天），作为第三磨牙拔除治疗方案的一部分常规规定会导致稳定的口腔微生物组发生显着变化。

主要结果指标是评估：

1. 通过口腔微生物组的 16 s r DNA 基因测序评估不同细菌在 5 个特定时间点的相对丰度。
2. 通过已知抗性基因微阵列和功能宏基因组学评估的已知抗生素抗性基因的相对丰度和表达。

次要成果措施是评估：

1. 通过在 2 个时间点测量唾液中 C 反应蛋白的水平来判断口腔是否存在炎症。
2. 治疗前和治疗后第一周内的临床体征和症状，以监测炎症和感染的存在。

计划进行常规手术摘除且书面同意参与研究的受试者将被招募。 接受过专业颌面外科培训 (ML Co-A) 的经验丰富的临床操作员将负责进行临床治疗。 抗生素的处方将根据病例的复杂程度、手术难度和所需时间而定。 因此，患者不会被随机化，而是基于每组获得 15 名患者。 这不是一项干预研究，并且由于患者正在接受预期的护理标准，因此没有高危人群。 将在七个观察时间点（基线、一周、两周、三周、一个月、三个月和六个月）收集唾液，并在四个观察时间点（基线、一周、一个月）收集龈上菌斑样本， 三个月 ）。 在获得知情同意后，将招募 15 名未接受拔牙或抗生素治疗的受试者作为对照组，并在相同的七个时间点进行随访。

受试者将被要求在进行样本采集的前一天晚上不要刷牙，并且同样被要求不要使用漱口水。 除收集时间点外，受试者将被要求在研究期间保持其“正常”、常规的口腔卫生程序。

收集唾液样本的七个时间点是：

基线

1. 星期
2. 周
3. 周

1个月 3个月 6个月

收集牙菌斑样本的三个时间点是：

基线 1 周

1个月 3个月

收集基线样本后，将进行第三磨牙的手术拔除。 将为所有受试者提供拔牙后说明和止痛药，为所有受试者提供止痛药，为需要抗生素的受试者提供阿莫西林。 将通过询问患者并在召回预约时检查阿莫西林片剂包装条来检查合规性。 受试者将被要求在一个月的研究期间避免使用任何漱口水（如果他们尚未这样做），并且将提供不含抗菌成分的牙膏供使用。

每个受试者将接受基线牙周检查，包括探测深度、临床附着丧失、牙龈指数、菌斑指数和牙龈刺激的测量，并将记录他们的口腔健康状况。

如下所述，将在所有指定时间点收集用于 DNA 提取的样本。 将在早上饭后至少两小时采集样本 将按照 Keijser 等人 (13) 的描述收集菌斑和唾液样本。将在早上采集样本 使用冷冻管收集 5 毫升唾液（Salimetrics ) 要求受试者将唾液被动地流到设备中。 样品将立即置于冰中并储存在-800C。 将使用无菌微刷从颊牙表面收集龈上菌斑样本。 样本采集后，刷尖将被切割并储存在 -800C 的 Eppendorf 管内。将对六颗牙齿（16、11、24、41、36 和 44）进行龈上牙菌斑采集。

将唾液样品涡旋并将两组 0.3 ml 体积的样品转移到两个带有 0.3 g 氧化锆二氧化硅珠的无菌双盖 Eppendorf 管中。

使用 C-反应蛋白 ELISA 试剂盒 (Salimetrics)，将使用 50 微升唾液测量基线和一周时的 C-反应蛋白水平。

通过添加 0.2 ml 苯酚并使用小型珠磨机 2 分钟将样品均化。 使用 DNA 提取试剂盒 (Qiagen) 提取 DNA。

16s r RNA 超可变区 V4 的扩增将使用引物完成，测序将使用 MiSeq 平台进行。

抗性基因的微阵列和功能宏基因组学将按照 Card 等人 (14) 的描述进行。

受试者治疗 这是一项前瞻性、纵向、观察性、队列研究，调查年轻人在术后使用和不使用抗生素的情况下接受智齿手术拔除。 术后会给予抗生素和止痛药。

阿莫西林 口服，每天 3 次，每次 250 毫克，持续 5 天 镇痛药 - Arcoxia 120 毫克，持续三天，扑热息痛 500 毫克 QID PRN，持续 3 天，或扑热息痛 1 克加磷酸可待因 16 毫克。 抗生素的处方将基于病例复杂性、创伤和手术时间长短的临床判断。 不会执行随机化。 将在五个观察时间点（基线、一周、两周、三周和一个月）收集唾液，并在三个观察时间点（基线、一周和一个月）收集龈上菌斑样本。将检查合规性通过询问患者并在召回预约时检查阿莫西林药片包装条。

疗效评估 该研究并未研究新药的疗效。 正在执行的治疗程序是根据常规治疗方案进行的。

安全性评估 该研究不关注新药的安全性。 正在执行的治疗程序是根据常规治疗方案进行的。

统计分析。 将使用 V4 正向引物 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 和 V4 反向引物 GGACTACHVGGGTWTCTAAT 为每个样本生成小亚基核糖体 RNA 基因 V4 超可变区的条形码扩增子文库，如 Schloss 在 http://www.mothur.org/wiki/File 中所述：湿实验室_MiSeq_SOP.pdf。 扩增子文库将以等摩尔量合并，并通过 Illumina MiSeq 系统进行测序。 测序数据将使用 QIIME (15) 和 UPARSE (16) 管道的组合进行处理。 经过质量过滤后，将使用 UPARSE 以 97% 的最小序列相似性将 reads 聚类到操作分类单元 (OTU) 中。 每个簇的代表性序列将使用核糖体数据库项目 (RDP) 分类器分配一个分类法，对 QIIME 的置信度为 80%。

为了对测序深度的差异进行归一化，将以相等数量的读数/样本对读数进行随机子采样。 通过主成分分析 (PCA) 对 log2 转换的 OTU 数据和多样性统计（香农多样性指数）、Bray-Curtis 相似性指数、单向置换多元方差分析（PERMANOVA）和相似性百分比（SIMPER）进行数据缩减使用 PAST 软件 (17)。 PCA 将用于通过治疗和访问可视化潜在的微生物组聚类。 香农多样性指数考虑了分类单元 (OTU) 的数量以及每个 OTU 对整个数据集的相对贡献。 Bray-Curtis 相似性指数介于 0 和 1 之间，其中 1 表示两个样本具有相同的成分，0 表示两个样本不共享任何物种。 该指数将用于评估访问 1（基线样本）与同一个人的所有其他访问之间微生物组的相似性。 这种方法允许及时量化微生物变化。 独立样本 T 检验将用于比较两个治疗组之间的微生物组变化。 PERMANOVA 将用于评估微生物组特征在两个治疗组之间是否存在统计学显着差异。 SIMPER 将用于识别对治疗组之间的差异贡献最大的 OTU。

微生物组分析输出：

每个样本类型（斑块和唾液）和每个时间点都将包含一个 OTU 表，其中包含每个样本的标准化读取计数以及每个 OTU 的相应分类分配；每个样本的香农多样性指数和上述统计分析。 使用加权 UniFrac 指标的聚类分析将用于分析不同时间点细菌的相对丰度。

访问源数据/文件 将允许访问与试验相关的监控、审计和 IRB 审查源数据/文件。

质量控制和质量保证 标准的临床检查形式将用于收集数据并由行政人员或 RA 人员输入。 临床检查员将接受培训，了解如何使用该表格并根据经验丰富的临床医生的输入做出临床判断，并在必要时进行校准。 所有拔牙都将由同一位专业临床医生进行，样本采集将由经过培训的临床检查员完成。

伦理 抗生素的处方将基于临床医生的判断和病例的复杂性。预计不会出现伦理问题，因为这是一种公认​​的常规治疗模式。

数据处理和记录保存 数据将由指定的临床检查员收集，他们将接受培训并指导如何收集数据。 行政人员和研究助理将输入数据。 记录的硬拷贝和软拷贝将由首席调查员和一名其他行政人员保存。 除研究团队外，不得访问此数据。

金融及保险 香港大学牙医学院 (PG Funds)

出版政策 研究结果和数据将在国际同行评审期刊和类似的国际会议上发表。