Vliv antibiotické léčby a extrakce na orální mikrobiom

Hypotéza Léčba amoxicilinu (250 mg, třikrát denně po dobu pěti dnů), rutinně předepisovaná jako součást léčebného protokolu pro extrakci třetího moláru, způsobuje významný posun stabilního orálního mikrobiomu.

Primárními výstupními opatřeními je posouzení:

1. Relativní početnost různých bakterií v 5 specifikovaných časových bodech hodnocená pomocí 16s r DNA genového sekvenování orálního mikrobiomu.
2. Relativní množství a exprese známých genů rezistence na antibiotika hodnocené pomocí mikročipu známých rezistentních genů a funkční metagenomiky.

Sekundární výsledná opatření mají posoudit:

1. Přítomnost zánětu v dutině ústní měřením hladin C-reaktivního proteinu ve slinách ve 2 časových bodech.
2. Klinické příznaky a symptomy před a během prvního týdne po léčbě ke sledování přítomnosti zánětu a infekce.

Budou přijati jedinci plánovaní na rutinní chirurgické extrakce, kteří dají písemný souhlas s účastí ve studii. Za provádění klinické léčby bude odpovědný zkušený klinický operátor s odborným školením v oblasti maxilofaciální chirurgie (ML Co-A). Předepisování antibiotik se bude odvíjet od složitosti případu, náročnosti operačního výkonu a času. Pacienti proto nebudou randomizováni, ale na základě získání 15 pacientů v každé skupině. Toto není intervenční studie a neexistuje žádná riziková skupina, protože pacienti dostávají očekávanou standardní péči. Sliny budou odebrány v sedmi časových bodech pozorování (základní stav, jeden týden, dva týdny, tři týdny, jeden měsíc, tři měsíce a šest měsíců) a vzorky supragingiválního plaku budou odebrány ve čtyřech časových bodech pozorování (základní stav, jeden týden, jeden měsíc , tři měsíce ). Kontrolní skupina 15 subjektů, které nepodstoupí extrakci zubů nebo léčbu antibiotiky, bude přijata po získání informovaného souhlasu a bude sledována po stejných sedm časových bodů.

Subjekty budou požádány, aby si noc před odběrem vzorků nečistily zuby, a podobně budou požádány, aby nepoužívaly zubní ústní vody. Kromě časových bodů odběru budou subjekty po dobu trvání studie požádány, aby dodržovaly své „normální“, rutinní postupy ústní hygieny.

Sedm časových bodů pro odběr vzorků slin je:

Základní linie

1. týden
2. týdnů
3. týdnů

1 měsíc 3 měsíce 6 měsíců

Tři časové body pro odběr vzorků plaku jsou:

Základní 1 týden

1 měsíc 3 měsíce

Po odběru základních vzorků bude provedena chirurgická extrakce třetího moláru. Subjekt dostane instrukce po extrakci a analgetika pro úlevu od bolesti pro všechny subjekty a amoxicilin pro ty, kteří vyžadují antibiotika. Compliance bude kontrolována dotazem pacienta a kontrolou obalových proužků tablet amoxicilinu při schůzkách s odvoláním. Subjekt bude požádán, aby se zdržel používání jakékoli ústní vody během jednoho měsíce studie (pokud tak již neučinil) a k použití bude poskytnuta zubní pasta bez antibakteriálního obsahu.

Každý subjekt podstoupí základní periodontální vyšetření, včetně měření hloubky sondování, klinické ztráty uchycení, indexu dásní, indexu plaku a podráždění dásní a zaznamená se jeho orální zdravotní stav.

Vzorky pro extrakci DNA budou odebírány ve všech specifikovaných časových bodech, jak je popsáno níže. Vzorky budou odebírány ráno alespoň dvě hodiny po jídle Odběr vzorků plaku a slin bude proveden tak, jak je popsáno Keijser et al (13). Vzorky budou odebrány ráno 5 ml slin bude odebráno pomocí kryozkumavek (Salimetrics ) tím, že požádáte subjekt, aby do zařízení pasivně slintal sliny. Vzorky budou okamžitě umístěny do ledu a skladovány při -80 °C. K odběru vzorků supragingiválního plaku z bukálních zubních povrchů bude použit sterilní mikrokartáček. Po odběru vzorku se hrot kartáčku odřízne a uloží do zkumavky Eppendorf při -80 °C. Odběr supragingiválního plaku se provede pro šest zubů (16, 11, 24, 41, 36 a 44).

Vzorky slin budou promíchány na vortexu a dvě sady o objemu 0,3 ml budou přeneseny do dvou sterilních Eppendorfových zkumavek se dvěma uzávěry s 0,3 g zirkoniových kuliček.

50 mikrolitrů slin bude použito pro měření výchozích hladin C-reaktivního proteinu a jeden týden pomocí soupravy C-Reactive Protein ELISA kit (Salimetrics).

Vzorky budou homogenizovány přidáním 0,2 ml fenolu a použitím mini šlehače kuliček po dobu 2 minut. DNA bude extrahována pomocí soupravy pro extrakci DNA (Qiagen).

Amplifikace 16s r RNA hypervariabilní oblasti V4 bude provedena pomocí primerů a sekvenování bude provedeno pomocí platformy MiSeq.

Microarray pro rezistentní geny a funkční metagenomiku bude prováděn tak, jak je popsáno v Card et al (14).

Léčba subjektů Toto je prospektivní, longitudinální, observační, kohortová studie zkoumající mladé dospělé podstupující pooperačně chirurgickou extrakci zubu moudrosti s antibiotiky a bez nich. Antibiotika a analgetika budou podávána po operaci.

Amoxicilin Intra perorálně, třikrát denně 250 mg po dobu 5 dnů Analgetika - Arcoxia 120 mg po dobu tří dnů a Paracetamol 500 mg QID PRN po dobu 3 dnů nebo Paracetamol 1 g Plus 16 mg kodeinfosfát. Předepisování antibiotik bude založeno na klinickém úsudku založeném na složitosti případu, traumatu a délce procedury. Nebude prováděna žádná randomizace. Sliny budou odebrány v pěti časových bodech pozorování (základní stav, jeden týden, dva týdny, tři týdny a jeden měsíc) a vzorky supragingiválního plaku budou odebrány ve třech časových bodech pozorování (základní stav, jeden týden a jeden měsíc). Dodržování bude kontrolováno nebo tak, že se pacienta zeptáte a zkontrolujete proužky obalu tablet amoxicilinu při schůzkách s odvoláním.

Hodnocení účinnosti Studie nezkoumá účinnost nového léku. Prováděné léčebné postupy jsou v souladu s konvenčním léčebným protokolem.

Hodnocení bezpečnosti Studie se nezabývá bezpečností nového léku. Prováděné léčebné postupy jsou v souladu s konvenčním léčebným protokolem.

Statistická analýza. Knihovny amplikonů s čárovým kódem malé podjednotky ribozomální RNA genu V4 hypervariabilní oblasti budou generovány pro každý vzorek pomocí V4 dopředného primeru GTGCCAGCMGCCGCGGTAA a V4 reverzního primeru GGACTACHVGGGTWTCTAAT, jak je popsáno Schlossem na http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Knihovny amplikonů budou sloučeny v ekvimolárních množstvích a sekvenovány pomocí systému Illumina MiSeq. Sekvenační data budou zpracována pomocí kombinace potrubí QIIME (15) a UPARSE (16). Po kvalitním filtrování budou čtení sdružena do operačních taxonomických jednotek (OTU) s minimální sekvenční podobností 97 % pomocí UPARSE. Reprezentativní sekvenci každého shluku bude přiřazena taxonomie pomocí klasifikátoru Ribosomal Database Project (RDP) s 80% spolehlivostí v QIIME.

Pro normalizaci rozdílů v hloubce sekvenování budou odečty náhodně podvzorkovány při stejném počtu čtení/vzorek. Bude provedena redukce dat analýzou hlavních komponent (PCA) na log2 transformovaných datech OTU a statistiky diverzity (Shannonův index diversity), Bray-Curtisův index podobnosti, jednosměrná permutační multivariační analýza rozptylu (PERMANOVA) a procento podobnosti (SIMPER). pomocí softwaru PAST (17). PCA bude použita k vizualizaci potenciálního shlukování mikrobiomu ošetřením a návštěvou. Shannonův index diverzity bere v úvahu počet taxonů (OTU) a relativní příspěvek každého OTU k celému souboru dat. Bray-Curtisův index podobnosti je v rozmezí 0 až 1, kde 1 znamená, že dva vzorky mají stejné složení a 0 znamená, že tyto dva vzorky nesdílejí žádný druh. Tento index bude použit k posouzení podobnosti mikrobiomů mezi návštěvou 1 (základní vzorek) a všemi ostatními návštěvami od stejného jedince. Tato metoda umožňuje kvantifikovat mikrobiální posun v čase. K porovnání posunů mikrobiomu mezi dvěma léčebnými skupinami bude použit T-test nezávislých vzorků. PERMANOVA bude použita k posouzení, zda se profily mikrobiomu statisticky významně liší mezi dvěma léčebnými skupinami. SIMPER bude použit k identifikaci OTU, které nejvíce přispívají k rozdílům mezi léčebnými skupinami.

Výstup analýzy mikrobiomu:

Pro každý typ vzorku (plak a sliny) a každý časový bod bude obsahovat tabulku OTU s normalizovanými počty odečtených na vzorek s příslušným taxonomickým přiřazením pro každou OTU; Shannonův index diverzity na jednotlivý vzorek a statistické analýzy uvedené výše. K analýze relativního množství bakterií v různých časových bodech bude použita shluková analýza pomocí vážených metrik UniFrac.

Přístup ke zdrojovým datům/dokumentům Přístup ke zdrojovým datům/dokumentům bude povolen pro účely monitorování, auditů a IRB kontroly.

Kontrola kvality a zajištění kvality Ke sběru dat se použije standardní proforma klinického vyšetření a vloží je administrativní pracovníci nebo pracovníci RA. Klinickí zkoušející budou vyškoleni, jak používat formulář a provádět klinické úsudky na základě informací od zkušených lékařů a v případě potřeby kalibrovat. Všechny extrakce zubů bude provádět stejný odborný klinik a odběr vzorků provedou vyškolení klinickí vyšetřovatelé.

Etika Předepisování antibiotik bude založeno na úsudku lékaře a složitosti případu. Neočekávají se žádné etické problémy, protože se jedná o přijímaný a rutinní způsob léčby.

Manipulace s daty a uchovávání záznamů Data budou shromažďována určenými klinickými vyšetřujícími, kteří budou vyškoleni a instruováni, jak data sbírat. Údaje zadají administrativní pracovníci a výzkumní asistenti. Tištěné a elektronické kopie záznamů budou uchovávány hlavním vyšetřovatelem a jedním dalším administrativním pracovníkem. Žádný přístup k těmto údajům nebude povolen kromě výzkumného týmu.

Financování a pojištění Fakulta zubního lékařství HKU (fondy PG)

Publikační politika Zjištění a údaje budou publikovány v mezinárodních recenzovaných časopisech a na podobných mezinárodních konferencích.