Wpływ leczenia antybiotykami i ekstrakcji na mikrobiom jamy ustnej

Hipoteza Kurs amoksycyliny (250 mg, trzy razy dziennie przez pięć dni), rutynowo przepisywany jako część protokołu leczenia ekstrakcji trzecich zębów trzonowych, powoduje znaczną zmianę stabilnego mikrobiomu jamy ustnej.

Podstawowymi miarami wyników są ocena:

1. Względna obfitość różnych bakterii w 5 określonych punktach czasowych oceniana przez sekwencjonowanie genu 16 s r DNA mikrobiomu jamy ustnej.
2. Względna liczebność i ekspresja znanych genów oporności na antybiotyki oceniana za pomocą mikromacierzy znanych genów oporności i funkcjonalnej metagenomiki.

Drugorzędne miary wyników mają na celu ocenę:

1. Obecność stanu zapalnego w jamie ustnej poprzez pomiar poziomu białka C-reaktywnego w ślinie w 2 punktach czasowych.
2. Kliniczne objawy przedmiotowe i podmiotowe przed iw trakcie pierwszego tygodnia po leczeniu w celu monitorowania obecności stanu zapalnego i infekcji.

Zrekrutowani zostaną pacjenci zakwalifikowani do rutynowych ekstrakcji chirurgicznych, którzy wyrażą pisemną zgodę na udział w badaniu. Za wykonanie leczenia klinicznego odpowiedzialny będzie doświadczony operator kliniczny ze specjalistycznym szkoleniem z chirurgii szczękowo-twarzowej (ML Co-A). Recepta antybiotyków będzie oparta na złożoności przypadku, trudności zabiegu operacyjnego i czasie trwania. Dlatego pacjenci nie będą randomizowani, ale w oparciu o uzyskanie 15 pacjentów w każdej grupie. To nie jest badanie interwencyjne i nie ma grupy ryzyka, ponieważ pacjenci otrzymują oczekiwany standard opieki. Ślina zostanie pobrana w siedmiu punktach czasowych obserwacji (linia bazowa, jeden tydzień, dwa tygodnie, trzy tygodnie, jeden miesiąc, trzy miesiące i sześć miesięcy), a próbki płytki naddziąsłowej zostaną zebrane w czterech punktach czasowych obserwacji (linia bazowa, jeden tydzień, jeden miesiąc , trzy miesiące ). Grupa kontrolna 15 pacjentów, którzy nie przechodzą ekstrakcji zębów ani leczenia antybiotykami, zostanie zwerbowana po uzyskaniu świadomej zgody i będzie obserwowana przez te same siedem punktów czasowych.

Osoby badane zostaną poproszone o powstrzymanie się od mycia zębów w noc poprzedzającą pobranie próbki i podobnie poproszone o niestosowanie płynów do płukania jamy ustnej. Poza punktami czasowymi pobierania próbek, uczestnicy zostaną poproszeni o zachowanie „normalnych”, rutynowych procedur higieny jamy ustnej przez cały czas trwania badania.

Siedem punktów czasowych pobierania próbek śliny to:

Linia bazowa

1. tydzień
2. tygodnie
3. tygodnie

1 miesiąc 3 miesiące 6 miesięcy

Trzy punkty czasowe pobierania próbek płytki nazębnej to:

Bazowy 1 tydzień

1 miesiąc 3 miesiące

Po pobraniu próbek wyjściowych zostanie przeprowadzona chirurgiczna ekstrakcja trzeciego zęba trzonowego. Osobnik otrzyma instrukcje po ekstrakcji i środki przeciwbólowe w celu złagodzenia bólu dla wszystkich pacjentów oraz amoksycylinę dla osób wymagających antybiotyków. Zgodność zostanie sprawdzona, pytając pacjenta i sprawdzając paski opakowania tabletki amoksycyliny podczas wizyt kontrolnych. Badany zostanie poproszony o powstrzymanie się od jakichkolwiek płynów do płukania jamy ustnej podczas miesięcznego okresu badania (jeśli jeszcze tego nie zrobił) i otrzyma do użytku pastę do zębów bez zawartości antybakteryjnej.

Każdy pacjent zostanie poddany podstawowemu badaniu periodontologicznemu, w tym pomiarom głębokości sondowania, klinicznej utraty przyczepu, wskaźnika dziąseł, wskaźnika płytki nazębnej i podrażnienia dziąseł, a stan zdrowia jamy ustnej zostanie odnotowany.

Próbki do ekstrakcji DNA będą pobierane we wszystkich określonych punktach czasowych, jak opisano poniżej. Próbki będą pobierane rano, co najmniej dwie godziny po posiłkach. Pobieranie próbek płytki nazębnej i śliny odbywa się zgodnie z opisem Keijsera i wsp. ) prosząc osobę badaną o bierne ślinienie się do urządzenia. Próbki zostaną natychmiast umieszczone w lodzie i przechowywane w temperaturze -80°C. Do pobrania próbek płytki naddziąsłowej z policzkowych powierzchni zębów zostanie użyta sterylna mikroszczoteczka. Po pobraniu próbki końcówka szczoteczki zostanie odcięta i umieszczona w probówce Eppendorfa w temperaturze -800C. Pobranie płytki naddziąsłowej zostanie wykonane dla sześciu zębów (16, 11,24,41,36 i 44).

Próbki śliny zostaną worteksowane i dwa zestawy po 0,3 ml zostaną przeniesione do dwóch sterylnych dwukorkowych probówek Eppendorfa z 0,3 g kulek cyrkonowo-krzemionkowych.

50 mikrolitrów śliny zostanie użyte do pomiaru poziomu białka C-reaktywnego na początku badania i po jednym tygodniu przy użyciu zestawu ELISA do badania białka C-reaktywnego (Salimetrics).

Próbki zostaną zhomogenizowane przez dodanie 0,2 ml fenolu i użycie mini ubijaka do kulek przez 2 minuty. DNA zostanie wyekstrahowane przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (Qiagen).

Amplifikacja regionu hiperzmiennego V4 16s r RNA zostanie przeprowadzona przy użyciu starterów, a sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone przy użyciu platformy MiSeq.

Mikromacierz genów oporności i funkcjonalna metagenomika zostaną przeprowadzone zgodnie z opisem Card i wsp. (14).

Leczenie pacjentów Jest to prospektywne, podłużne, obserwacyjne badanie kohortowe obejmujące młodych dorosłych poddawanych chirurgicznej ekstrakcji zęba mądrości z i bez antybiotyków po operacji. Antybiotyki i środki przeciwbólowe zostaną podane po operacji.

Amoksycylina Doustnie, trzy razy dziennie 250 mg przez 5 dni Leki przeciwbólowe - Arcoxia 120 mg przez trzy dni i Paracetamol 500 mg QID PRN przez 3 dni lub Paracetamol 1 g plus 16 mg fosforanu kodeiny. Recepta antybiotyków będzie oparta na ocenie klinicznej na podstawie złożoności przypadku, urazu i długości procedury. Żadna randomizacja nie zostanie przeprowadzona. Ślina zostanie pobrana w pięciu punktach czasowych obserwacji (linia bazowa, jeden tydzień, dwa tygodnie, trzy tygodnie i jeden miesiąc), a próbki płytki naddziąsłowej zostaną pobrane w trzech punktach czasowych obserwacji (linia bazowa, tydzień i jeden miesiąc). Zgodność zostanie sprawdzona pytając pacjenta i sprawdzając paski amoksycyliny z opakowania tabletki podczas wizyt kontrolnych.

Ocena skuteczności Badanie nie dotyczy skuteczności nowego leku. Przeprowadzane procedury leczenia są zgodne z konwencjonalnym protokołem leczenia.

Ocena bezpieczeństwa Badanie nie dotyczy bezpieczeństwa nowego leku. Przeprowadzane procedury leczenia są zgodne z konwencjonalnym protokołem leczenia.

Analiza statystyczna. Biblioteki amplikonów z kodem kreskowym regionu hiperzmiennego V4 genu rybosomalnego RNA małej podjednostki zostaną wygenerowane dla każdej z próbek przy użyciu startera do przodu V4 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA i startera do tyłu V4 GGACTACHVGGGGTWTCTAAT, jak opisał Schloss w http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Biblioteki amplikonów zostaną zebrane w równomolowe ilości i zsekwencjonowane za pomocą systemu Illumina MiSeq. Dane sekwencjonowania będą przetwarzane przy użyciu kombinacji potoków QIIME (15) i UPARSE (16). Po filtrowaniu jakości odczyty zostaną zgrupowane w Operacyjne Jednostki Taksonomiczne (OTU) przy minimalnym podobieństwie sekwencji wynoszącym 97% przy użyciu UPARSE. Reprezentatywnej sekwencji każdego klastra zostanie przypisana taksonomia przy użyciu klasyfikatora Ribosomal Database Project (RDP) z 80% pewnością w QIIME.

Aby znormalizować różnice w głębokości sekwencjonowania, odczyty będą losowo podpróbkowane przy równej liczbie odczytów/próbki. Zostanie przeprowadzona redukcja danych za pomocą analizy głównych składowych (PCA) na danych OTU przekształconych w log2 i statystykach różnorodności (wskaźnik różnorodności Shannona), wskaźnika podobieństwa Bray-Curtisa, jednokierunkowej permutacyjnej wielowymiarowej analizy wariancji (PERMANOVA) i procentu podobieństwa (SIMPER) za pomocą oprogramowania PAST (17). PCA zostanie wykorzystany do wizualizacji potencjalnego skupienia mikrobiomu w zależności od leczenia i wizyty. Indeks różnorodności Shannona uwzględnia liczbę taksonów (OTU) i względny udział każdego OTU w całym zbiorze danych. Wskaźnik podobieństwa Braya-Curtisa wynosi od 0 do 1, gdzie 1 oznacza, że ​​dwie próbki mają ten sam skład, a 0 oznacza, że ​​te dwie próbki nie mają wspólnego gatunku. Ten wskaźnik zostanie zastosowany do oceny podobieństwa mikrobiomów między wizytą 1 (próbka podstawowa) a wszystkimi innymi wizytami tej samej osoby. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie przesunięcia drobnoustrojów w czasie. Test T niezależnych próbek zostanie wykorzystany do porównania przesunięć mikrobiomu między dwiema grupami leczenia. PERMANOVA zostanie wykorzystany do oceny, czy profile mikrobiomu różnią się istotnie statystycznie między dwiema grupami leczenia. SIMPER zostanie wykorzystany do zidentyfikowania OTU, które najbardziej przyczyniają się do różnic między grupami leczenia.

Wynik analizy mikrobiomu:

Dla każdego typu próbki (płytka nazębna i ślina) i dla każdego punktu czasowego będzie zawierać tabelę OTU ze znormalizowanymi liczbami odczytów na próbkę z odpowiednim przypisaniem taksonomicznym dla każdej OTU; Shannon Diversity Index na pojedynczą próbkę oraz analizy statystyczne, o których mowa powyżej. Analiza skupień przy użyciu ważonych metryk UniFrac zostanie wykorzystana do analizy względnej obfitości bakterii w różnych punktach czasowych.

Dostęp do danych/dokumentów źródłowych Dostęp do danych/dokumentów źródłowych będzie dozwolony na potrzeby monitorowania, audytów i przeglądu IRB.

Kontrola jakości i zapewnienie jakości Standardowy formularz badania klinicznego zostanie wykorzystany do zebrania danych i wprowadzony przez personel administracyjny lub RA. Egzaminatorzy kliniczni zostaną przeszkoleni w zakresie korzystania z formularza i dokonywania ocen klinicznych w oparciu o informacje przekazane przez doświadczonych klinicystów, aw razie potrzeby zostaną skalibrowani. Wszystkie ekstrakcje zębów będą wykonywane przez tego samego klinicystę-specjalistę, a pobieranie próbek będzie wykonywane przez przeszkolonych lekarzy orzeczników.

Etyka Przepisy antybiotykowe będą oparte na ocenie klinicysty i złożoności przypadku. Nie przewiduje się żadnych problemów etycznych, ponieważ jest to akceptowany i rutynowy sposób leczenia.

Przetwarzanie danych i przechowywanie danych Dane będą zbierane przez wyznaczonych lekarzy orzeczników, którzy zostaną przeszkoleni i poinstruowani, jak zbierać dane. Dane będą wprowadzać pracownicy administracyjni i asystenci naukowi. Twarde i miękkie kopie akt będą przechowywane przez głównego badacza i jeszcze jednego pracownika administracyjnego. Żaden dostęp do tych danych nie będzie możliwy poza zespołem badawczym.

Finansowanie i Ubezpieczenia Wydział Stomatologii HKU (Fundusze PG)

Zasady publikowania Ustalenia i dane zostaną opublikowane w międzynarodowych recenzowanych czasopismach i na podobnych konferencjach międzynarodowych.