Impact van antibioticabehandeling en -extractie op het orale microbioom

Hypothese Een kuur met amoxicilline (250 mg, driemaal daags gedurende vijf dagen), routinematig voorgeschreven als onderdeel van het behandelingsprotocol voor het trekken van een derde molaar, veroorzaakt een significante verschuiving van het stabiele orale microbioom.

De primaire uitkomstmaten zijn het beoordelen van:

1. Relatieve overvloed aan verschillende bacteriën op 5 gespecificeerde tijdstippen beoordeeld door 16 sr DNA-gensequencing van het orale microbioom.
2. Relatieve overvloed en expressie van bekende antibioticaresistentiegenen beoordeeld door een microarray van bekende resistente genen en functionele metagenomica.

Secundaire uitkomstmaten zijn het beoordelen van:

1. Aanwezigheid van ontsteking in de mondholte door meting van de niveaus van C-reactief proteïne in het speeksel op 2 tijdstippen.
2. Klinische tekenen en symptomen voor en tijdens de eerste week na de behandeling om de aanwezigheid van ontsteking en infectie te controleren.

Proefpersonen die zijn ingepland voor routinematige chirurgische extracties en die schriftelijk toestemming geven om deel uit te maken van het onderzoek, zullen worden aangeworven. Een ervaren klinische operator met een gespecialiseerde opleiding tot maxillofaciale chirurgie (ML Co-A) zal verantwoordelijk zijn voor het uitvoeren van de klinische behandeling. Het voorschrijven van antibiotica zal gebaseerd zijn op de complexiteit van de zaak, de moeilijkheidsgraad van de operatieve chirurgische ingreep en de benodigde tijd. Daarom worden patiënten niet gerandomiseerd, maar gebaseerd op het verkrijgen van 15 patiënten in elke groep. Dit is geen interventiestudie en er is geen risicogroep aangezien patiënten de verwachte zorgstandaard krijgen. Speeksel wordt verzameld op zeven observatietijdstippen (baseline, één week, twee weken, drie weken, één maand, drie maanden en zes maanden) en supragingivale plaquemonsters worden verzameld op vier observatietijdstippen (baseline, één week, één maand , drie maanden ). Een controlegroep van 15 proefpersonen die geen tandextracties of antibioticabehandeling ondergaan, zal worden aangeworven na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming en zal gedurende dezelfde zeven tijdspunten worden gevolgd.

De proefpersonen zullen worden gevraagd om hun tanden niet te poetsen de avond voordat de monsterafname moet worden uitgevoerd en evenzo wordt gevraagd om geen mondwater te gebruiken. Afgezien van de verzameltijdstippen, wordt de proefpersonen gevraagd om hun 'normale' routinematige mondhygiëneprocedures voor de duur van het onderzoek te handhaven.

Zeven tijdstippen voor het verzamelen van speekselmonsters zijn:

Basislijn

1. week
2. weken
3. weken

1 maand 3 maanden 6 maanden

Drie tijdstippen voor het verzamelen van plaquemonsters zijn:

Basislijn 1 week

1 maand 3 maanden

Na het verzamelen van de basismonsters zal de chirurgische extractie van de derde molaar worden uitgevoerd. De proefpersoon krijgt na-extractie-instructies en pijnstillers voor pijnverlichting voor alle proefpersonen en amoxicilline voor degenen die antibiotica nodig hebben. Naleving zal worden gecontroleerd door de patiënt te vragen en de tabletverpakkingsstrips van amoxicilline te controleren bij de terugroepafspraken. De proefpersoon wordt gevraagd af te zien van het gebruik van mondspoeling gedurende de onderzoeksperiode van een maand (als hij dit nog niet heeft gedaan) en er zal een tandpasta zonder antibacteriële inhoud worden verstrekt.

Elke proefpersoon ondergaat een parodontaal basisonderzoek, inclusief metingen van sondedieptes, verlies van klinische aanhechting, tandvleesindex, plaque-index en tandvleesirritatie, en hun mondgezondheidsstatus zal worden geregistreerd.

Monsters voor DNA-extractie worden verzameld op alle gespecificeerde tijdstippen, zoals hieronder beschreven. Monsters worden 's ochtends genomen, ten minste twee uur na de maaltijd. Verzameling van plaque- en speekselmonsters wordt gedaan zoals beschreven door Keijser et al (13). Monsters worden 's ochtends genomen. 5 ml speeksel wordt verzameld met behulp van cryovials (Salimetrics ) door de proefpersoon te vragen passief speeksel in het apparaat te kwijlen. Monsters worden onmiddellijk in ijs geplaatst en bewaard bij -80°C. Een steriele microborstel zal worden gebruikt om supragingivale plaquemonsters van de buccale tandoppervlakken te verzamelen. Na monsterafname wordt de punt van de borstel afgesneden en in een Eppendorf-buis bij -80°C bewaard. De supragingivale plaqueafname wordt gedaan voor zes tanden (16, 11, 24, 41, 36 en 44).

Speekselmonsters zullen worden gevortext en twee sets van 0,3 ml volumes zullen worden overgebracht naar twee steriele Eppendorf-buisjes met twee doppen met 0,3 g zirkonia-siliciumparels.

50 microliter speeksel zal worden gebruikt voor de meting van C-reactieve proteïneniveaus bij baseline en één week met behulp van C-reactieve proteïne ELISA-kit (Salimetrics).

De monsters worden gehomogeniseerd door 0,2 ml fenol toe te voegen en gedurende 2 minuten een miniparelklopper te gebruiken. DNA wordt geëxtraheerd met behulp van een DNA-extractiekit (Qiagen).

Amplificatie van het 16s r RNA hypervariabele gebied V4 zal worden gedaan met behulp van primers en de sequentiebepaling zal worden uitgevoerd met behulp van het MiSeq-platform.

Microarray voor de resistente genen en functionele metagenomics zullen worden uitgevoerd zoals beschreven door Card et al (14).

Behandeling van proefpersonen Dit is een prospectieve, longitudinale, observationele cohortstudie waarin jonge volwassenen worden onderzocht die postoperatief chirurgische extractie van een verstandskies met en zonder antibiotica ondergaan. Antibiotica en analgetica zullen postoperatief worden gegeven.

Amoxicilline Intra oraal, driemaal daags 250 mg gedurende 5 dagen Analgetica - Arcoxia 120 mg gedurende drie dagen en Paracetamol 500 mg QID PRN gedurende 3 dagen of Paracetamol 1 g plus 16 mg codeïnefosfaat. Het voorschrijven van antibiotica zal gebaseerd zijn op klinisch oordeel op basis van de complexiteit van de zaak, het trauma en de duur van de procedure. Er wordt geen randomisatie uitgevoerd. Speeksel wordt verzameld op vijf observatietijdstippen (basislijn, één week, twee weken, drie weken en één maand) en supragingivale plaquemonsters worden verzameld op drie observatietijdstippen (basislijn, één week en één maand). Naleving wordt gecontroleerd voor door de patiënt te vragen en de tabletwikkelstroken van amoxicilline te controleren bij de terugroepafspraken.

Beoordeling van de werkzaamheid De studie onderzoekt niet de werkzaamheid van een nieuw geneesmiddel. De behandelingsprocedures die worden uitgevoerd zijn volgens het conventionele behandelprotocol.

Beoordeling van de veiligheid De studie kijkt niet naar de veiligheid van een nieuw medicijn. De behandelingsprocedures die worden uitgevoerd zijn volgens het conventionele behandelprotocol.

Statistische analyse. Ampliconbibliotheken met streepjescode van het kleine subeenheid ribosomale RNA-gen V4 hypervariabele regio zullen worden gegenereerd voor elk van de monsters met behulp van V4 forward primer GTGCCAGCMGCCGCGGTAA en V4 reverse primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT zoals beschreven door Schloss in http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. De amplicon-bibliotheken zullen worden samengevoegd in equimolaire hoeveelheden en gesequenced door middel van het Illumina MiSeq-systeem. De sequentiegegevens worden verwerkt met behulp van een combinatie van QIIME (15) en UPARSE (16) pijplijnen. Na kwaliteitsfiltering worden de reads geclusterd in Operational Taxonomic Units (OTU's) met een minimale sequentieovereenkomst van 97% met behulp van UPARSE. De representatieve sequentie van elk cluster krijgt een taxonomie toegewezen met behulp van de Ribosomal Database Project (RDP) classifier met 80% vertrouwen in QIIME.

Om te normaliseren voor verschillen in sequencing-diepte, worden de uitlezingen willekeurig gesubsampled met een gelijk aantal uitlezingen/monsters. Gegevensreductie door hoofdcomponentenanalyse (PCA) op log2 getransformeerde OTU-gegevens en de diversiteitsstatistieken (Shannon Diversity Index), Bray-Curtis-overeenkomstindex, eenrichtingspermutatie multivariate variantieanalyse (PERMANOVA) en overeenkomstpercentage (SIMPER) zullen worden uitgevoerd met PAST-software (17). PCA zal worden gebruikt om de potentiële microbioomclustering per behandeling en per bezoek te visualiseren. De Shannon Diversity-index houdt rekening met het aantal taxa (OTU's) en de relatieve bijdrage van elke OTU aan de hele dataset. De Bray-Curtis-vergelijkingsindex ligt tussen 0 en 1, waarbij 1 betekent dat twee monsters dezelfde samenstelling hebben en 0 betekent dat de twee monsters geen enkele soort delen. Deze index wordt toegepast om de overeenkomst in microbiomen tussen bezoek 1 (basismonster) en alle andere bezoeken van dezelfde persoon te beoordelen. Met deze methode kan de microbiële verschuiving in de tijd worden gekwantificeerd. Independent samples T-test zal worden gebruikt om de microbioomverschuivingen tussen de twee behandelingsgroepen te vergelijken. PERMANOVA zal worden gebruikt om te beoordelen of de microbioomprofielen statistisch significant verschillen tussen de twee behandelingsgroepen. SIMPER zal worden gebruikt om de OTU's te identificeren die het meest bijdragen aan de verschillen tussen de behandelingsgroepen.

Uitvoer microbioomanalyse:

Per elk monstertype (plaque en speeksel) en elk tijdstip zal een OTU-tabel worden opgenomen met genormaliseerde leestellingen per monster met de respectieve taxonomische toewijzing voor elke OTU; Shannon Diversity Index per individueel monster en de bovengenoemde statistische analyses. Clusteranalyse met behulp van gewogen UniFrac-metrieken zal worden gebruikt om de relatieve hoeveelheid bacteriën op verschillende tijdstippen te analyseren.

Toegang tot brongegevens/documenten Toegang is toegestaan ​​voor aan het onderzoek gerelateerde monitoring, audits en IRB-beoordeling van brongegevens/documenten.

Kwaliteitscontrole en kwaliteitsborging Er wordt een standaard proforma voor klinisch onderzoek gebruikt om gegevens te verzamelen en ingevoerd door administratief of RA-personeel. Klinische examinatoren zullen worden getraind in het gebruik van het formulier en het maken van klinische beoordelingen op basis van input van ervaren clinici en waar nodig gekalibreerd. Alle tandextracties worden uitgevoerd door dezelfde deskundige clinicus en het verzamelen van monsters wordt gedaan door getrainde klinische onderzoekers.

Ethiek Het voorschrijven van antibiotica zal gebaseerd zijn op het oordeel van de clinicus en de complexiteit van de zaak. Er worden geen ethische kwesties verwacht aangezien dit een geaccepteerde en routinematige behandelingsmethode is.

Gegevensverwerking en het bijhouden van gegevens Gegevens worden verzameld door aangewezen klinische examinatoren die worden opgeleid en geïnstrueerd hoe de gegevens moeten worden verzameld. Administratief personeel en onderzoeksassistenten voeren de gegevens in. De hoofdonderzoeker en één ander administratief personeel zullen papieren en papieren kopieën van de dossiers bewaren. Alleen het onderzoeksteam heeft geen toegang tot deze gegevens.

Financiering en verzekering HKU Faculteit Tandheelkunde (PG Fondsen)

Publicatie Beleid Bevindingen en gegevens zullen worden gepubliceerd in internationale peer-reviewed tijdschriften en op vergelijkbare internationale conferenties.