Impact du traitement antibiotique et de l'extraction sur le microbiome oral

Hypothèse Une cure d'amoxicilline (250 mg, trois fois par jour pendant cinq jours), systématiquement prescrite dans le cadre du protocole de traitement des extractions de troisièmes molaires, provoque un déplacement significatif du microbiome oral stable.

Les principaux critères de jugement consistent à évaluer :

1. Abondance relative de différentes bactéries à 5 moments précis évalués par séquençage du gène ADN 16 s r du microbiome oral.
2. Abondance relative et expression des gènes connus de résistance aux antibiotiques évaluées par un microréseau de gènes résistants connus et métagénomique fonctionnelle.

Les critères de jugement secondaires consistent à évaluer :

1. Présence d'inflammation dans la cavité buccale en mesurant les niveaux de protéine C-réactive dans la salive à 2 moments.
2. Signes et symptômes cliniques avant et pendant la première semaine après le traitement pour surveiller la présence d'inflammation et d'infection.

Les sujets programmés pour des extractions chirurgicales de routine qui donnent un consentement écrit pour faire partie de l'étude seront recrutés. Un opérateur clinique expérimenté avec une formation spécialisée en chirurgie maxillo-faciale (ML Co-A) sera responsable de la réalisation du traitement clinique. La prescription d'antibiotiques sera basée sur la complexité du cas, la difficulté de la procédure chirurgicale opératoire et le temps nécessaire. Par conséquent, les patients ne seront pas randomisés mais basés sur l'obtention de 15 patients dans chaque groupe. Il ne s'agit pas d'une étude d'intervention et il n'y a pas de groupe à risque car les patients reçoivent les soins de qualité attendus. La salive sera collectée à sept moments d'observation (ligne de base, une semaine, deux semaines, trois semaines, un mois, trois mois et six mois) et des échantillons de plaque supragingivale seront collectés à quatre moments d'observation (ligne de base, une semaine, un mois , trois mois ). Un groupe témoin de 15 sujets qui ne subissent pas d'extractions dentaires ou de traitement antibiotique seront recrutés après avoir obtenu leur consentement éclairé et seront suivis pendant les sept mêmes moments.

Il sera demandé aux sujets de s'abstenir de se brosser les dents la veille du prélèvement d'échantillons et de même de ne pas utiliser de bains de bouche dentaires. Outre les moments de collecte, les sujets seront invités à maintenir leurs procédures d'hygiène bucco-dentaire de routine « normales » pendant toute la durée de l'étude.

Sept points temporels pour le prélèvement d'échantillons de salive sont :

Ligne de base

1. semaine
2. semaines
3. semaines

1 mois 3 mois 6 mois

Trois points temporels pour la collecte d'échantillons de plaque sont :

Base 1 semaine

1 mois 3 mois

Après la collecte des échantillons de base, l'extraction chirurgicale de la troisième molaire sera effectuée. Le sujet recevra des instructions post-extraction et des analgésiques pour soulager la douleur pour tous les sujets et de l'amoxicilline pour ceux nécessitant des antibiotiques. L'observance sera vérifiée en interrogeant le patient et en vérifiant les bandelettes d'emballage des comprimés d'amoxicilline lors des rendez-vous de rappel. Il sera demandé au sujet de s'abstenir d'utiliser tout bain de bouche pendant la période d'étude d'un mois (s'il ne l'a pas déjà fait) et un dentifrice sans contenu antibactérien sera fourni pour utilisation.

Chaque sujet subira un examen parodontal de base, y compris des mesures des profondeurs de sondage, de la perte d'attache clinique, de l'indice gingival, de l'indice de plaque et de l'irritation gingivale et leur état de santé bucco-dentaire sera enregistré.

Les échantillons pour l'extraction d'ADN seront prélevés à tous les moments spécifiés, comme décrit ci-dessous. Les échantillons seront prélevés le matin au moins deux heures après les repas. La collecte des échantillons de plaque et de salive se fera comme décrit par Keijser et al (13). Les échantillons seront prélevés le matin. ) en demandant au sujet de baver passivement de la salive dans l'appareil. Les échantillons seront immédiatement placés dans de la glace et stockés à -80°C. Une microbrosse stérile sera utilisée pour prélever des échantillons de plaque supragingivale sur les surfaces dentaires buccales. Après le prélèvement de l'échantillon, la pointe de la brosse sera coupée et stockée dans un tube Eppendorf à -80°C. Le prélèvement de la plaque supragingivale sera effectué pour six dents (16, 11, 24, 41, 36 et 44).

Les échantillons de salive seront vortexés et deux ensembles de volumes de 0,3 ml seront transférés dans deux tubes Eppendorf stériles à deux bouchons avec des billes de silice de zircone de 0,3 g.

50 microlitres de salive seront utilisés pour la mesure des niveaux de protéine C-réactive au départ et une semaine à l'aide du kit ELISA C-Reactive Protein (Salimetrics).

Les échantillons seront homogénéisés en ajoutant 0,2 ml de phénol et en utilisant un mini batteur à billes pendant 2 minutes. L'ADN sera extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN (Qiagen).

L'amplification de la région hyper variable V4 de l'ARN 16s r se fera à l'aide d'amorces et le séquençage sera effectué à l'aide de la plateforme MiSeq.

La puce à ADN pour les gènes résistants et la métagénomique fonctionnelle seront réalisées comme décrit par Card et al (14).

Traitement des sujets Il s'agit d'une étude de cohorte prospective, longitudinale, observationnelle portant sur de jeunes adultes subissant une extraction chirurgicale d'une dent de sagesse avec et sans antibiotiques après l'opération. Des antibiotiques et des analgésiques seront administrés en postopératoire.

Amoxicilline Intra orale, trois fois par jour 250 mg pendant 5 jours Analgésiques - Arcoxia 120 mg pendant trois jours et Paracétamol 500 mg QID PRN pendant 3 jours ou Paracétamol 1 g Plus 16 mg de phosphate de codéine. La prescription d'antibiotiques sera basée sur un jugement clinique basé sur la complexité du cas, le traumatisme et la durée de la procédure. Aucune randomisation ne sera effectuée. La salive sera collectée à cinq moments d'observation (ligne de base, une semaine, deux semaines, trois semaines et un mois) et des échantillons de plaque supragingivale seront collectés à trois moments d'observation (ligne de base, une semaine et un mois). La conformité sera vérifiée pour en demandant au patient et en vérifiant les bandes d'emballage des comprimés d'amoxicilline lors des rendez-vous de rappel.

Évaluation de l'efficacité L'étude ne porte pas sur l'efficacité d'un nouveau médicament. Les procédures de traitement effectuées sont conformes au protocole de traitement conventionnel.

Évaluation de l'innocuité L'étude ne porte pas sur l'innocuité d'un nouveau médicament. Les procédures de traitement effectuées sont conformes au protocole de traitement conventionnel.

Analyses statistiques. Des bibliothèques d'amplicons à code-barres de la région hyper variable V4 du gène de l'ARN ribosomal de la petite sous-unité seront générées pour chacun des échantillons à l'aide de l'amorce directe V4 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA et de l'amorce inverse V4 GGACTACHVGGGTWTCTAAT comme décrit par Schloss dans http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Les bibliothèques d'amplicons seront regroupées en quantités équimolaires et séquencées au moyen du système Illumina MiSeq. Les données de séquençage seront traitées à l'aide d'une combinaison de pipelines QIIME (15) et UPARSE (16). Après un filtrage de qualité, les lectures seront regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) avec une similarité de séquence minimale de 97 % à l'aide d'UPARSE. La séquence représentative de chaque cluster se verra attribuer une taxonomie à l'aide du classificateur Ribosomal Database Project (RDP) avec une confiance de 80 % dans QIIME.

Pour normaliser les différences de profondeur de séquençage, les lectures seront sous-échantillonnées de manière aléatoire à un nombre égal de lectures/échantillon. La réduction des données par analyse en composantes principales (ACP) sur les données OTU transformées en log2 et les statistiques de diversité (indice de diversité de Shannon), l'indice de similarité Bray-Curtis, l'analyse multivariée permutationnelle unidirectionnelle de la variance (PERMANOVA) et le pourcentage de similarité (SIMPER) seront effectuées à l'aide du logiciel PAST (17). L'ACP sera utilisée pour visualiser le regroupement potentiel du microbiome par traitement et par visite. L'indice de diversité de Shannon prend en compte le nombre de taxons (OTU) et la contribution relative de chaque OTU à l'ensemble de données. L'indice de similarité Bray-Curtis est compris entre 0 et 1, où 1 signifie que deux échantillons ont la même composition et 0 signifie que les deux échantillons ne partagent aucune espèce. Cet indice sera appliqué pour évaluer la similarité des microbiomes entre la visite 1 (échantillon de référence) et toutes les autres visites du même individu. Cette méthode permet de quantifier le déplacement microbien dans le temps. Des tests T d'échantillons indépendants seront utilisés pour comparer les changements de microbiome entre les deux groupes de traitement. PERMANOVA sera utilisé pour évaluer si les profils de microbiome diffèrent de manière statistiquement significative entre les deux groupes de traitement. SIMPER sera utilisé pour identifier les UTO qui contribuent le plus aux différences entre les groupes de traitement.

Résultat de l'analyse du microbiome :

Pour chaque type d'échantillon (plaque et salive) et chaque point temporel comprendra un tableau OTU avec des nombres de lectures normalisés par échantillon avec l'affectation taxonomique respective pour chaque OTU ; Shannon Diversity Index par échantillon individuel et les analyses statistiques mentionnées ci-dessus. L'analyse par grappes à l'aide de mesures UniFrac pondérées sera utilisée pour analyser l'abondance relative des bactéries à différents moments.

Accès aux données/documents sources L'accès sera autorisé pour la surveillance, les audits et l'examen par la CISR des données/documents sources liés aux essais.

Contrôle de la qualité et assurance de la qualité Un formulaire d'examen clinique standard sera utilisé pour collecter les données et saisi par le personnel administratif ou RA. Les examinateurs cliniques seront formés à l'utilisation du formulaire et à la formulation de jugements cliniques basés sur les commentaires de cliniciens expérimentés et, si nécessaire, calibrés. Toutes les extractions dentaires seront effectuées par le même clinicien expert et la collecte des échantillons sera effectuée par des examinateurs cliniques formés.

Éthique La prescription d'antibiotiques sera basée sur le jugement du clinicien et la complexité du cas. Aucun problème d'éthique n'est prévu puisqu'il s'agit d'un mode de traitement accepté et courant.

Traitement des données et tenue des dossiers Les données seront recueillies par des examinateurs cliniques désignés qui seront formés et instruits sur la façon de recueillir les données. Le personnel administratif et les assistants de recherche saisiront les données. Des copies papier et électronique des dossiers seront conservées par l'enquêteur principal et un autre membre du personnel administratif. Aucun accès à ces données ne sera autorisé en dehors de l'équipe de recherche.

Financement et assurance Faculté de médecine dentaire HKU (PG Funds)

Politique de publication Les résultats et les données seront publiés dans des revues internationales à comité de lecture et lors de conférences internationales similaires.