Effekten av antibiotikabehandling og ekstraksjon på det orale mikrobiomet

Hypotese En kur med amoxicillin (250 mg, tre ganger daglig i fem dager), rutinemessig foreskrevet som en del av behandlingsprotokollen for tredje molare ekstraksjoner forårsaker en betydelig endring av det stabile orale mikrobiomet.

De primære utfallsmålene er å vurdere:

1. Relativ overflod av forskjellige bakterier ved 5 spesifiserte tidspunkter vurdert ved 16 s r DNA-gensekvensering av det orale mikrobiomet.
2. Relativ overflod og ekspresjon av kjente antibiotikaresistensgener vurdert av en mikroarray av kjente resistente gener og funksjonell metagenomikk.

Sekundære utfallsmål er å vurdere:

1. Tilstedeværelse av betennelse i munnhulen ved å måle nivåene av C-reaktivt protein i spyttet ved 2 tidspunkter.
2. Kliniske tegn og symptomer før og i løpet av den første uken etter behandling for å overvåke tilstedeværelsen av betennelse og infeksjon.

Personer som er planlagt for rutinemessige kirurgiske ekstraksjoner som gir skriftlig samtykke til å være en del av studien, vil bli rekruttert. En erfaren klinisk operatør med spesialistutdanning i kjevekirurgi (ML Co-A) vil være ansvarlig for å utføre klinisk behandling. Forskrivning av antibiotika vil være basert på tilfellets kompleksitet, vanskelighetsgraden ved det operative kirurgiske inngrepet og tiden det tar. Pasienter vil derfor ikke randomiseres, men basert på å få 15 pasienter i hver gruppe. Dette er ikke en intervensjonsstudie, og det er ingen risikogruppe ettersom pasienter mottar forventet behandlingsstandard. Spytt vil bli samlet inn ved syv observasjonstidspunkter (grunnlinje, en uke, to uker, tre uker, en måned, tre måneder og seks måneder) og supragingival plakkprøver vil bli samlet inn ved fire observasjonstidspunkter (grunnlinje, en uke, en måned) , tre måneder ). En kontrollgruppe på 15 forsøkspersoner som ikke gjennomgår tannekstraksjoner eller antibiotikabehandling vil bli rekruttert etter innhentet informert samtykke og vil bli fulgt opp i de samme syv tidspunktene.

Forsøkspersonene vil bli bedt om å avstå fra å pusse tennene kvelden før prøvetaking skal utføres, og på samme måte bedt om å ikke bruke munnvann. Bortsett fra innsamlingstidspunkter, vil forsøkspersonene bli bedt om å opprettholde sine "normale" rutinemessige munnhygieneprosedyrer så lenge studien varer.

Syv tidspunkt for innsamling av spyttprøver er:

Grunnlinje

1. uke
2. uker
3. uker

1 måned 3 måneder 6 måneder

Tre tidspunkter for innsamling av plakkprøver er:

Utgangspunkt 1 uke

1 måned 3 måneder

Etter innsamling av basislinjeprøvene vil kirurgisk ekstraksjon av den tredje molartannen bli utført. Pasienten vil få instruksjoner etter ekstraksjon og smertestillende midler for smertelindring for alle pasientene og amoxicillin for de som trenger antibiotika. Overholdelse vil bli sjekket ved å spørre pasienten og sjekke amoxicillin-strimlene på tablettinnpakningen ved tilbakekallingsavtalene. Forsøkspersonen vil bli bedt om å avstå fra å bruke munnskylling i løpet av studieperioden på én måned (hvis de ikke allerede har gjort det), og en tannkrem uten antibakterielt innhold vil bli gitt for bruk.

Hvert individ vil gjennomgå en baseline periodontal undersøkelse, inkludert målinger av sonderingsdybder, klinisk tilknytningstap, gingivalindeks, plakkindeks og gingivalirritasjon, og deres orale helsestatus vil bli registrert.

Prøver for DNA-ekstraksjon vil bli samlet på alle de angitte tidspunktene som beskrevet nedenfor. Prøver vil bli tatt om morgenen minst to timer etter måltider Innsamling av plakk- og spyttprøver vil bli gjort som beskrevet av Keijser et al (13). Prøver vil bli tatt om morgenen 5 ml spytt vil bli samlet inn ved bruk av kryovialer (Salimetrics). ) ved å be personen passivt sikle spytt inn i enheten. Prøver legges i is umiddelbart og lagres ved -800C. En steril mikrobørste vil bli brukt til å samle supragingivale plakkprøver fra de bukkale tannoverflatene. Etter prøvetaking vil tuppen av børsten kuttes og lagres inne i et Eppendorf-rør ved -800C. Supragingival plakkinnsamling vil bli utført for seks tenner (16, 11, 24, 41, 36 og 44).

Spyttprøver vil bli vortexet og to sett med 0,3 ml volumer vil bli overført til to sterile Eppendorf-rør med to hetter med 0,3 g zirkoniumoksyd-silikakuler.

50 mikroliter spytt vil bli brukt til måling av C - reaktive proteinnivåer ved baseline og en uke ved bruk av C- Reactive Protein ELISA-sett (Salimetrics).

Prøvene homogeniseres ved å tilsette 0,2 ml fenol og bruke en mini perlevisper i 2 minutter. DNA vil bli ekstrahert ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett (Qiagen).

Amplifisering av 16s r RNA hyper variabel region V4, vil bli gjort ved hjelp av primere og sekvenseringen vil bli utført ved hjelp av MiSeq-plattformen.

Mikroarray for de resistente genene og funksjonell metagenomikk vil bli utført som beskrevet av Card et al (14).

Behandling av forsøkspersoner Dette er en prospektiv, longitudinell, observasjons-, kohortstudie som undersøker unge voksne som gjennomgår kirurgisk ekstraksjon av en visdomstann med og uten antibiotika postoperativt. Antibiotika og analgetika vil bli gitt postoperativt.

Amoxicillin Intra oralt, tre ganger daglig 250 mg i 5 dager Analgetika - Arcoxia 120 mg i tre dager og Paracetamol 500 mg QID PRN i 3 dager eller Paracetamol 1 g Pluss 16 mg Kodeinfosfat. Forskrivning av antibiotika vil være basert på klinisk skjønn basert på sakskompleksitet, traumer og prosedyrelengde. Ingen randomisering vil bli utført. Spytt vil bli samlet inn ved fem observasjonstidspunkter (grunnlinje, én uke, to uker, tre uker og én måned) og supragingival plakkprøver vil bli samlet inn ved tre observasjonstidspunkter (grunnlinje, én uke og én måned). Overholdelse vil bli kontrollert for ved å spørre pasienten og sjekke tablettinnpakningsstrimlene av amoxicillin ved tilbakekallingsavtalene.

Vurdering av effekt Studien ser ikke på effekten av et nytt medikament. Behandlingsprosedyrene som utføres er i henhold til den konvensjonelle behandlingsprotokollen.

Vurdering av sikkerhet Studien ser ikke på sikkerheten til et nytt medikament. Behandlingsprosedyrene som utføres er i henhold til den konvensjonelle behandlingsprotokollen.

Statistisk analyse. Strekkodede amplikonbiblioteker av den lille underenheten ribosomale RNA-genet V4 hypervariable regionen vil bli generert for hver av prøvene ved å bruke V4 forward primer GTGCCAGCMGCCGCGGTAA og V4 revers primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT som beskrevet av Schloss i http://www.mothur.org/wiki/File :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Amplikonbibliotekene vil bli slått sammen i ekvimolare mengder og sekvensert ved hjelp av Illumina MiSeq-systemet. Sekvenseringsdataene vil bli behandlet ved hjelp av en kombinasjon av QIIME (15) og UPARSE (16) rørledninger. Etter kvalitetsfiltrering vil avlesningene bli gruppert i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) med en minimal sekvenslikhet på 97 % ved bruk av UPARSE. Den representative sekvensen til hver klynge vil bli tildelt en taksonomi ved å bruke Ribosomal Database Project (RDP) klassifikatoren med 80 % sikkerhet for QIIME.

For å normalisere for forskjeller i sekvenseringsdybde, vil avlesningene bli tilfeldig subsamplet ved like mange avlesninger/prøver. Datareduksjon ved hovedkomponentanalyse (PCA) på log2-transformerte OTU-data og mangfoldsstatistikken (Shannon Diversity Index), Bray-Curtis Similarity Index, enveis permutasjonell multivariat variansanalyse (PERMANOVA) og likhetsprosent (SIMPER) vil bli utført ved å bruke PAST-programvare (17). PCA vil bli brukt til å visualisere potensiell mikrobiom-klyngning ved behandling og ved besøk. Shannon Diversity Index tar hensyn til antall taxa (OTU) og det relative bidraget fra hver OTU til hele datasettet. Bray-Curtis Similarity Index er bundet mellom 0 og 1, der 1 betyr at to prøver har samme sammensetning og 0 betyr at de to prøvene ikke deler noen art. Denne indeksen vil bli brukt for å vurdere likheten i mikrobiomer mellom besøk 1 (grunnlinjeprøve) og alle andre besøk fra samme individ. Denne metoden gjør det mulig å kvantifisere mikrobiell endring i tid. Uavhengige prøver T-test vil bli brukt for å sammenligne mikrobiomskiftene mellom de to behandlingsgruppene. PERMANOVA vil bli brukt til å vurdere om mikrobiomprofilene skiller seg statistisk signifikant mellom de to behandlingsgruppene. SIMPER vil bli brukt til å identifisere de OTUene som bidrar mest til forskjellene mellom behandlingsgruppene.

Mikrobiomanalyseutgang:

For hver prøvetype (plakk og spytt) og hvert tidspunkt vil inkludere en OTU-tabell med normaliserte avlesningstall per prøve med den respektive taksonomiske tilordningen for hver OTU; Shannon Diversity Index per enkelt utvalg og de statistiske analysene nevnt ovenfor. Klyngeanalyse ved bruk av vektede UniFrac-målinger vil bli brukt til å analysere den relative forekomsten av bakterier på forskjellige tidspunkter.

Tilgang til kildedata/dokumenter Tilgang vil bli tillatt for prøverelatert overvåking, revisjoner og IRB-gjennomgang til kildedata/dokumenter.

Kvalitetskontroll og kvalitetssikring En standard klinisk undersøkelsesproforma vil bli brukt til å samle inn data og legges inn av administrativt personale eller RA-personell. Kliniske sensorer vil få opplæring i bruk av skjemaet og foreta kliniske vurderinger basert på innspill fra erfarne klinikere og om nødvendig kalibrert. Alle tannekstraksjoner vil bli utført av den samme ekspertklinikeren og prøvetakingen vil bli utført av trente kliniske undersøkere.

Etikk Forskrivning av antibiotika vil være basert på klinikerens vurdering og sakskompleksitet. Det forventes ingen etiske problemer siden dette er en akseptert og rutinemessig behandlingsmåte.

Datahåndtering og journalføring Data vil bli samlet inn av utpekte kliniske undersøkere som vil bli opplært og instruert i hvordan dataene skal samles inn. Administrative ansatte og forskningsassistenter vil legge inn dataene. Papir og myke kopier av journaler vil bli oppbevart av hovedetterforskeren og en annen administrativ medarbeider. Ingen tilgang til disse dataene vil bli tillatt bortsett fra forskerteamet.

Finansiering og forsikring HKU Det odontologiske fakultet (PG-fond)

Publikasjonspolitikk Funn og data vil bli publisert i internasjonale fagfellevurderte tidsskrifter og på lignende internasjonale konferanser.