歯科用接着剤への銅および亜鉛ナノ粒子の取り込みの効果 (1170575)

一般的な目的 抗菌作用に対する歯科用接着剤への銅または亜鉛ナノ粒子の組み込みの影響、および象牙質マトリックス メタロプロテアーゼ活性に対するそれらの影響を評価すること。 接着剤の機械的特性と生体適合性を分析する 仕様 目的

1. 銅または亜鉛のナノ粒子をドープした歯科用接着剤を開発し、構造的に特徴付けること。

   1.1。 接着性ナノコンポジットの調製; 1.2. 接着性ナノコンポジットの構造特性。

2. in vitro で接着性ナノコンポジットの機械的、生化学的、機能的効果を評価する。 アッセイは、コントロール接着剤の添加、または最近抜歯したばかりの新鮮な歯への銅または亜鉛のいずれかをドープした接着剤の比較に対処します。 生体内段階） 2.1。 接着剤の抗菌活性をテストするには; 2. 2. マトリックスメタロプロテアーゼのレベルおよび/または活性に対する接着性ナノコンポジットの影響を研究する;2.3. 接着剤の機械的特性を評価する;2.4. 生体適合性を評価する。 初代培養歯肉線維芽細胞における生存率アッセイが取り上げられます。
3. in vivo モデル (臨床段階) の抗菌特性、マトリックス メタロプロテアーゼおよびカテプシン B レベルおよび/または活性、in vivo での接着性ナノコンポジットの生体適合性、および機械的特性を評価する。 抜歯が指示された小臼歯は、従来の接着剤または接着剤ナノコンポジットのいずれかを使用して修復されます。 1 か月後、小臼歯が抜歯され、説明どおりに分析されます。

3.1. 接着剤ナノコンポジットの表面抗菌特性を決定します。 3.2. 浸軟した象牙質組織におけるマトリックスメタロプロテアーゼおよびカテプシン B レベルおよび/または活性を評価する;3.3 生体適合性を判断する。 歯髄は抽出された小臼歯から得られ、接着性ナノコンポジットの細胞生存率または細胞損傷の分子マーカーが扱われます;3.4 接着剤の機械的特性を評価します。

方法

1. 銅または亜鉛のナノ粒子をドープした歯科用接着剤を開発する。 1.1。 接着剤ナノコンポジットの調製 (1): ワンボトル接着剤システム Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk, Milford, DE) を使用して、CuNP/接着剤ナノコンポジットを調製します。 このアセトンベースの接着剤には、ウレタンジメタクリレートと酸性モノマージペンタエリスリトールペンタアクリレートモノホスフェートの混合物が含まれています。 接着剤ナノコンポジットを調製するには、適切な量のナノ粒子粉末 (CuNp および ZnNp、Sigma Aldrich、サンティアゴ、チリ) を秤量し、一定の磁気攪拌下で接着剤ボトルに直接追加します。 次いで、懸濁液を超音波浴中で３７℃で１０分間さらに分散させる。 接着剤ナノコンポジットは、当社の研究室からの以前のデータによると、0.015 から 0.045 wt.% の範囲の CuNP 含有量で調製されます。 Cu および Zn ドープ接着剤の 5 つの濃度は、0.0150%、0.0075%、および 0.00038% になります (以前のデータ (Cu 1-2-3 および Zn 1-2-3) に基づく抗菌活性特性を持つ濃度)。

   1.2. 接着性ナノコンポジットの構造特性評価 (1): ナノコンポジット接着剤材料の形態と組成は、反射電子モードの SEM-EDX によって特徴付けられ、位相差と AFM 顕微鏡法を生成します。 ポリマーマトリックスの化学構造と残留モノマー含有量は、減衰全反射フーリエ変換赤外線およびラマン分光法によって分析されます。 残留モノマーは、1684 ～ 1636 cm-1 の範囲のアクリル モノマーの炭素間二重結合振動を考慮して分析されます。

2. in vitro および ex vivo での接着性ナノ複合材料の抗菌性、機械的、生化学的および機能的効果を評価すること。 通常の接着剤の添加、または銅または亜鉛のいずれかをドープした接着剤の添加を比較するアッセイに対処します。

   2.1. 接着性ナノコンポジットの抗菌特性の評価 (2) 2.1.1 抗菌活性: 簡単に言うと、厚さ 2 mm の 10 mm ディスクを樹脂複合材 (Filtek Supreme Ultra; 3M、セントポール、ミネソタ州) を使用して製造し、コーティングしないまま (コントロール) または接着剤 Prime&Bond 2.1 でコーティングし、同等の実験的LED 光硬化ユニット (Radii Cal、SDI、AU) を 1000 mW/cm2 の電力密度で使用して、12 のグループの接着剤ブレンドを製造業者の推奨に従って 10 秒間重合させました。 アマルガム ディスク (等高線; カー、カリフォルニア州オレンジ) は、前述のように作成され、追加の陽性対照として使用されます。 実験のこの部分では、1 グループあたり 8 つの標本を持つ合計 14 の研究グループが評価されます。 (2) アマルガム (陽性対照のように使用される金属材料) および 3) Cu 1、4) Cu 2、5) Cu 3,6) Zn1,7) Zn2 および 8) Zn3。 重合していないモノマーを確実に除去するために、ディスクを 10 mL の滅菌脱イオン水に浸し、200 rpm および 37.8 °C で 2 時間攪拌した後、ディスクを室温で少なくとも 24 時間乾燥させます。 ディスクは、70% エタノールで 10 分間インキュベートすることにより滅菌し、次に最低 48 時間無菌乾燥させます。 各ディスクの表面に、嫌気的に増殖させた 1 108 細胞/mL の定義された生存濃度 100 mL を接種します。ブレイン ハート インフュージョン (BHI; 211059; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) ブロス中の ATCC1 25175 ミュータンス連鎖球菌。 . mL あたりのコロニー形成単位 (CFU/ml) で各処理グループの生細胞濃度を決定するには、接種したディスクを嫌気的に行い、その後、回収された CFU の総数を決定します。

   2.2. MMP 活性の in vitro および ex vivo 評価 (1-2) 2.2.1 MMP 活性阻害アッセイ (in vitro): in vitro での MMP-2、MMP-8、および MMP-9 の定量的活性は、市販の MMP 蛍光定量アッセイによって決定されます。抗MMP活性のスクリーニングのためのキット（SensoLyteアッセイキット; AnaSpec、カリフォルニア州サンノゼ）。 異なる濃度の Cu および ZnNP ドープ接着剤と、Cu または ZnNP 接着剤を含まないコントロールを反応バッファーに追加し、製造元の推奨に従ってアッセイを実行します。 MMP による 2 つの別個のフラグメントへの切断時に、5-FAM の蛍光を蛍光マイクロプレートリーダー (Sinergy TM) でモニターします。

   2.2.2 MMP 活性およびレベルの測定 (ドーピングされた接着剤およびコントロールを使用して修復された歯から得られたサンプルを含む ex vivo 象牙質サンプル): 25 (n=5) の摘出された齲蝕のないヒトの第 3 大臼歯は、患者の情報を得た後に収集されます。同意。 歯は 0.5% クロラミンで消毒され、蒸留水で保存され、抜歯後 6 か月以内に使用されます。 標準化された寸法 3x3x5 mm の小さな咬合準備は、シリンダー ダイヤモンド バー (109/018、ミディアム グリット (60730025)、Dentsply、NY、USA) を使用して、キャリブレーションされたオペレーターによって歯の中心で行われます。エアウォータースプレーを提供しながらハンドピース。 キャビティの準備が完了したら、レジン コンポジット (Filtek Supreme; 3M ESPE) を充填します。 Cu と Zn でドープされた実験用接着剤は、製造元の指示に従って使用され、ドープされていない接着剤は、相同な上顎小臼歯のコントロールとして使用されます。 樹脂複合材 (Filtek Supreme; 3M ESPE) はインクリメンタル技術を使用して適用されます。 エナメル質は、低速のダイヤモンドソー (Remet、ボローニャ、イタリア) を使用して生理食塩水で完全に除去され、歯は切断されて厚さ 1 mm の冠状象牙質ウエハーが得られます。スチールハンマー。 次に、象牙質粉末を次のいずれかの水溶液で均等に分割し、脱灰します（4℃で 24 時間攪拌）。 (2) 0.26 M クエン酸、pH = 2.3。または (3) 0.5 M EDTA、pH = 6.4。または (4) 0.5 M EGTA、pH = 6.4。 脱塩象牙質粉末の酵素抽出は、抽出バッファー (5 mM CaCl2、100 mM NaCl、0.1% Triton X-100、0.1% NONIDET P-40、0.1 mM ZnCl2、 0.02% NaN3) および EDTA フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル (Sigma Chemical、セントルイス、ミズーリ州、米国)。 次に、サンプルを4°Cでそれぞれ10秒間の3バーストで40 W出力で超音波処理します（Sonicator Ultrasonic Liquid Processor Model W-385、Heat Systems-Ultrasonic Inc.、Farmingdale、NY、USA）。 バイアルを 18,000 rpm で 30 分間、4°C で遠心分離し、上清を回収します。 上清に存在するすべてのタンパク質は、粉末硫酸アンモニウム (w/v) を添加して 4°C で沈殿させ、最終濃度 85% および pH 7.0 を達成します。 沈殿物を 24,000 rpm で 30 分間、4°C で遠心分離して収集し、抽出バッファーで 10 倍希釈して再溶解し、抽出バッファーに対して 30 kDa 膜を通して一晩透析し、分析するまで 4°C で保存します。 この後、前述のように象牙質粉末を分析して、MMP-2、MMP-9、およびカテプシン B の活性レベルをゼラチン ザイモグラフィーで測定し、MMP-8 をコラーゲン ザイモグラフィーで評価します.56 デンシトメトリーは du (Gel Logic 2200 pro Imaging System、Carestream Health、USA) として表されます。 簡単に言えば、基質として 1 mg/mL のゼラチンまたは 0.1 mg/mL のコラーゲンを含む SDS/PAGE ゲルで、象牙質粉末サンプルを非還元変性条件下で電気泳動にかけます。 次に、それらを 2.5% Triton X-100 に 2 回浸し、展開バッファー (20 mM Tris pH 7.4 および 5 mM CaCl2) で 17 時間インキュベートし、Coomassie Brilliant Blue R-250 で染色し、10% 酢酸で脱色し、 20% メタノール溶液。 MMP-2、MMP-8、MMP-9、カテプシン B、および ICTP (象牙質コラーゲン加水分解のマーカーとして) のレベルは、市販の ELISA キットまたはマルチプレックス イムノアッセイ (R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、米国、 Luminex テクノロジーの場合) メーカーの推奨に従ってください。

   2.3. 接着性ナノコンポジットの機械的特性試験 (1-2) 結合強度 2.3.1 歯の選択と準備: チリ大学の歯科医院 (≒2000 第三年間の大臼歯の抜歯により、通常は廃棄されるこれらの歯の利用可能性が確保されます)。 歯は 0.5% クロラミンで消毒され、蒸留水で保存され、抜歯後 6 か月以内に使用されます。 #180 SiCペーパーで咬合エナメル質を湿式研磨すると、平らな象牙質表面が露出します。 露出した象牙質の表面は、濡れた #600 SiC ペーパーで 60 秒間さらに研磨して、スミア層を標準化します。

   2.3.2 実験計画: 歯はランダムに 5 つのグループ (接着剤ごとに 6 つのグループ) に割り当てられ、それぞれが異なる濃度のドープされた接着剤で処理されます。システム Prime & Bond 2.1 (Dentsply Caulk、Milford 、DE) が使用されます。

   2.3.3. 修復手順と標本の準備: 接着剤システムは、それぞれの製造元の指示に従って厳密に適用されます。

   2.3.4 接着処置後: すべての歯に、2 mm ずつ 2 回ずつマイクロ ハイブリッド コンポジット修復物を取り付けます。 各増分は、1200 mW/cm2 設定で LED 光硬化ユニットを使用して 40 秒間光重合されます (Radii-cal; SDI Limited、Bayswater、Victoria、Australia)。 修復された歯は、37°C​​ の蒸留水中で 24 時間保存され、その後、低速ダイヤモンドソー (Isomet; Buehler Ltd., Lake Bluff, IL) 15 ～ 20 のレジン - 象牙質スティックを取得し、デジタル キャリパー (デジマチック キャリパー; ミツトヨ、東京、日本) で測定した場合、それぞれの断面積は約 0.8 mm2 です。ランダムに選択された6つのレジン象牙質結合試験片を除いて、強度（mTBS）はその場での変換度（DC）とナノリーク（NL）の測定のために分割されます。

   2.3.5. マイクロ引張結合強度試験: シアノアクリレート接着剤を使用して、レジン象牙質結合スティックを Geraldeli のジグに取り付け、0.5 mm/分で破断するまで張力 (Kratos Dinamometros、Cotia、SP、ブラジル) でテストします。 mTBS 値は、破損時の荷重を接合断面積で割ることによって計算されます。 試験片の破損モードは、粘着性 (象牙質またはレジン コンポジット内のみの破損)、接着性 (レジン/象牙質界面での破損)、または混合 (隣接する基質の凝集破損を含むレジン/象牙質界面での破損) に分類されます。 ）。 分類は、100 倍の倍率で実体顕微鏡 (SZ40; オリンパス、東京、日本) で実行されます。 早期故障 (PF) のある試験片は平均値に含まれます。

   2.3.6. その場での変換の程度: 各歯からの 3 つのレジン象牙質結合スティックは、#1500、#2000、および #2500 の SiC 紙で湿式研磨されます。 次に、それらを 20 分間超音波洗浄し、DC を測定する前に 37.8°C の水中で 24 時間保存します。 Ｓｅｎｔｅｒｒａ装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｋ ＧｍｂＨ、エトリンゲン、バーデン・ヴュルテンベルク、ドイツ）を使用してマイクロラマン分光分析を実施する。 マイクロラマン分光計のキャリブレーションは、それをゼロにリセットし、シリコン試料の係数を測定することによって実行されます。 標本は、次のマイクロ ラマン パラメーターを使用して分析されます: 532 nm で 20 mW のネオン レーザー、3 mm での空間分解能、5 cm-1 でのスペクトル分解能、6 回の共添加による 30 秒での蓄積時間、および 110x での倍率 ( Olympus UK、London、UK) から 1 mm のビーム径まで。 スペクトルは、レジン-象牙質結合スティックごとに管間象牙質内の 3 つの異なる部位の象牙質-接着界面で取得されます。 重合していない接着剤のスペクトルが参照として使用されます。 スペクトルの後処理は、専用の Opus Spectroscopy ソフトウェア バージョン 6.5 を使用して実行されます。 接着剤中のモノマーとポリマーの二重結合含有量の比率が計算されます。ここで、「R」は、重合および非重合接着剤の 1639 cm-1 および 1609 cm-1 における脂肪族および芳香族のピーク面積の比率です。 同じ歯からのすべてのレジン象牙質結合スティックの in situ DC は、統計目的で平均化されます。

   2.3.7. ナノリーク評価: 各歯からの 3 本のレジン結合スティックを、Tay らによって記述されたプロトコールに従って調製されたアンモニア硝酸銀に入れ、暗所で 24 時間保存します。 次に、それらを蒸留水で十分にすすぎ、蛍光灯の下で 8 時間、写真現像液に浸して、結合界面に沿った空隙内で銀イオンを金属銀粒子に還元します。 標本は、#600、#1000、#1200、#1500、#2000、および #2500 の SiC 紙と、1 mm および 0.25 mm のダイヤモンド ペースト (Buehler Ltd.、イリノイ州レイク ブラフ) を使用して湿式研磨されます。磨き布。 それらは超音波洗浄され、空気乾燥され、スタブに取り付けられ、カーボンゴールド (MED 010; Balzers Union、Balzers、Liechtenstein) でコーティングされます。 樹脂と象牙質の界面は、後方散乱モードで動作する電界放射型走査型電子顕微鏡 (LEO 435 VP; LEO Electron Microscopy Ltd.、ケンブリッジ、英国) で分析されます。 各レジン象牙質結合スティックの 3 つの画像がキャプチャされます。 各試験片の接着層とハイブリッド層内の NL の相対割合は、盲目の研究者が Image J ソフトウェアを使用してすべての画像で測定されます。 同じ標本からの値が平均化され、同じ歯からのすべてのスティックの平均 NL が平均になります。

   2.4 生体適合性の評価、初代培養歯肉線維芽細胞の生存率アッセイ 2.4.1 細胞培養: ヒト線維芽細胞の初代培養は、3 人の成人男性の第 3 大臼歯の臼歯後組織から、外植法によって得られます。

   骨芽細胞と生体材料との間の生体適合性を評価するために一般的に使用される Saos-2 ヒト骨肉腫細胞株は、Alcaide et al.60 の記載に従って培養されます。

   細胞は、ウェルあたり3000細胞の密度で96ウェルプレートに播種されます。 24時間後、対照培地を100μlの適切な接着剤の異なる希釈液（10％、0.1％、1％、0.01％、0％）に置き換えます。生存率または細胞死アッセイの前に、°C インキュベーター (5%CO2)。

   2.4.2 細胞生存率および細胞周期分析: ヒト線維芽細胞の初代培養は、3 人の成人男性の第 3 大臼歯の臼後組織から外植法によって得られます。

   骨芽細胞と生体材料との間の生体適合性を評価するために一般的に使用される Saos-2 ヒト骨肉腫細胞株は、Alcaide et al.60 の記載に従って培養されます。

   細胞は、ウェルあたり3000細胞の密度で96ウェルプレートに播種されます。 24時間後、対照培地を100μlの適切な接着剤の異なる希釈液（10％、0.1％、1％、0.01％、0％）に置き換えます。生存率または細胞死アッセイの前に、°C インキュベーター (5%CO2)。

   2.4.3 蛍光顕微鏡による生存細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、および壊死細胞の定量化: Kasibhatla らによって記述されたプロトコルが使用されます 61。 細胞は、アクリジン オレンジ/エチジウム ブロマイド溶液 (AO/EB) で染色され、蛍光顕微鏡で検査されます。 AO は生細胞と死細胞の両方を染色します。 EB は、膜の完全性を失った細胞のみを染色します。 生細胞は一様に緑色に見えます。 初期のアポトーシス細胞は、クロマチンの凝縮と核の断片化の結果として、緑色に染色され、核内に明るい緑色の点が含まれます。 後期アポトーシス細胞も臭化エチジウムを取り込むため、オレンジ色に染まりますが、壊死細胞とは対照的に、後期アポトーシス細胞は凝縮し、しばしば断片化した核を示します。 壊死細胞はオレンジ色に染まりますが、核の形態は生細胞に似ており、凝縮したクロマチンはありません61。

   2.4.4 ホスファチジルセリン露出、DNA ラダーリング、およびアポトーシス mRNA およびタンパク質の定量によるアポトーシスの検出: 原形質膜の外面上のホスファチジルセリンの露出は、アネキシン V (A5)-アロフィコシアニン (APC) で染色することにより、アポトーシスの初期シグナルとして分析されます。 Alcaide et al60に記載されているように。 プローブ APC の蛍光は、フローサイトメトリーによって分析されます。

   アポトーシスDNAラダーアッセイは、DNAラダーキット（Roche、ドイツ）を使用して実施されます。

   腫瘍抑制因子 (p53)、プロアポトーシス (bax、カスパーゼ 3)、および抗アポトーシス (bcl-2) メディエーターの mRNA およびタンパク質レベルは、定量的 PCR およびイムノブロットを使用して対処されます。

   2.4.5 オートファジーの評価: 細胞のオートファジーに対する金属 NP の推定効果をテストするために、さまざまなオートファジー マーカーが扱われます。 オートファジー フラックスと p62 レベルはウエスタンブロットによって検出され、オートファゴソームは LC3 陽性 puncta63 をカウントすることによって蛍光顕微鏡によって視覚化されます。

3. インビボでの接着性ナノコンポジットのメタロプロテアーゼレベルおよび/または活性および生体適合性の評価。

   抜歯が指示された小臼歯は、従来の接着剤または接着剤ナノコンポジットのいずれかを使用して修復されます。 1 か月後 (電話による連絡と診療所での検査の後)、患者は検査され、小臼歯が抽出され、記載されているすべての段階でブラインド評価者 (番号で体系化) によって分析されます。 前臼歯の抜歯は歯科の教師が行い、処置後の影響は研究チームが想定して解決し、患者の処置は無料で、すべてが学部の倫理委員会の推奨事項に厳密に準拠します。チリ大学の歯学部。

   3.1 接着性ナノコンポジットの生体内評価: 歯列矯正の理由で右上および左の第一小臼歯の抜歯を必要とする 70 人のボランティア (グループあたり n = 35) が、チリ大学の診療所の歯列矯正専門プログラムから選択されます (あるモニタリングを担当する共同研究者（CB）との3か月の募集期間である）。 包含基準は、(1) 歯列矯正の理由で小臼歯の抜歯を示す治療計画、(2) 健康で、無傷で、虫歯がなく、修復されておらず、完全に萌出した治療歯があること、および (3) 健康状態が良好に管理されている患者であることです。最小限のリスクですべての手順を研究で実行できるようにします。 除外基準は、（1）研究への志願に同意しない患者、および（2）すべての選択基準を満たさない患者です。小さな咬合準備は、シリンダーダイヤモンドを使用して歯の中心で較正されたオペレーターによって行われますバー (.63109/018、ミディアム グリット (60730025)、Dentsply、NY、USA) と高速ハンド ピースで、標準化された寸法 3x3x5 mm のエアウォーター スプレーを提供します。 キャビティの準備が完了したら、レジン コンポジット (Filtek Supreme; 3M ESPE) を充填します。 Cu と Zn でドープされた実験用接着剤は、製造元の指示に従って使用され、ドープされていない接着剤は、相同な上顎小臼歯のコントロールとして使用され、並列グループの単純なランダム化によって設計されます。 レジン コンポジット (Filtek Supreme; 3M ESPE) はインクリメンタル テクニックを使用して適用され、最後に、接着剤の 1 つのコートがコンポジット修復の表面として適用され、10 秒間重合されます。 咬合がチェックされ、メーカーの指示に従って修復物が仕上げられ、研磨されます。 続いて、研磨と最終仕上げを使用して、最終修復物に接着剤の層を塗布し、10 秒間重合させます (Raddi Cal、SDI、AU)。 修復物を作成してから1か月後に、1本ずつ抜歯します。 患者は、エピネフリンを 1:100,000 (18 mg) の比率で使用して、浸潤麻酔および靭帯内麻酔 (約 1.8 mL 2% メピバカイン (36 mg)) を受けます。 その後、歯の検査を行います。

   3.2 接着剤ナノコンポジットの表面抗菌特性の決定: ドープされた接着剤の抗菌表面特性を評価するために、in vivo モデルで修復物の最終表面に接着剤の最終層を適用します。 この手順は、複合表面上の S.Mutans の CFU 数を評価するために使用されます (主な結果)。 バイオフィルムをサンプリングする前に、修復物の上にバイオフィルムを印刷するためのトレイが準備されます。 このアプリケーションでは、使い捨てのフッ化物ゲル アプリケーション トレイ (Deepak Products Inc.、マイアミ、米国) を使用し、それぞれをバイオセーフティ フード (Esco Technologies Inc.、ハーバーロ、米国) で紫外線下で 30 分間滅菌します。 次に、各トレイに 7.5 ml の TYCSB 寒天培地 (カゼイン、酵母エキス、L-システイン、スクロース、バシトラシン) (Difco Laboratories Inc.、米国ミシガン州デトロイト) を加えます。これは S. mutans の選択培地です。 その後、サンプル収集技術を個別化するために、トレイは 3 本の歯に収まるようにカットされます。 この直後に、トレイを滅菌ペトリ皿に置き、密閉したビニール袋に入れて冷蔵庫に保管します。 使用前に、品質管理手段としてトレイをインキュベーター/ストーブ (ZDP-A2080、LabTech Co.、Namyangiu、韓国) に 37 °C で 24 時間入れます。 3 番目と 4 番目のオペレーターは、朝のブラッシング後のバイオフィルムの再編成を可能にするために、11:00 ～ 13:00 の間に実施されるサンプリングを実行します。 サンプリングは、盲目のオペレーターがトレイを RC 修復物の上に 20 秒間静かに押し付けることによって実行され、その後、Cu または Zn ドープ接着剤を使用する場合と使用しない場合の同種の RC 修復物が続きます。

   サンプル トレイを滅菌ペトリ プレートに保存した後、4 ° C で輸送し、37 ° C で微好気性 (ジャー キャンドル CO2 10%) で 48 時間インキュベートします。 S.mutans のカウントは、RC 修復物を印刷するために使用されたトレイに目がくらんでいる 4 番目のオペレーターによって実行されます。 その後、コロニーの微細形態を決定するためにグラム染色が行われます。 Ｓ．ｍｕｔａｎｓカウントは、ＴＹＣＳＢ寒天を含むプレートおよびトレイからのＳ．ｍｕｔａｎｓのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で表される。 S.mutans の接着と形態学的特徴に適合するコロニーを選択し、Todd-Hewitt ブロス (Difco Laboratories Inc.、米国ミシガン州デトロイト) に懸濁し、37 °C で 48 時間インキュベートします。 次に、コロニーを生化学的試験にかけ、S. mutans の種を特定し、S. sobrinus と区別します。 生化学試験には、ラフィノース発酵、メリビオース発酵、エスクリン加水分解試験が含まれます。 3 つのすべてのテストで陽性の結果が得られた場合、S. mutans の存在が示されます。

   3.3 浸軟した象牙質組織におけるメタロプロテアーゼレベルおよび/または活性の評価は、2.4.2 と同様の方法論を使用します。 .65 は、以前の手順で修復された、新たに抽出された非齲蝕性の人間の上前臼歯 20 (グループごとに n = 5) で使用されます。 エナメル質とセメント質を除去した後、中/深部冠状象牙質の厚さ 1 mm のディスクが得られます。 フルオレセイン標識ゼラチンの 1.0 mg/mL ストック溶液は、凍結乾燥基質を含むバイアルに 1.0 mL の水を加えて調製し、使用するまで -20 °C で保存しました。 ゼラチン原液を希釈緩衝液 (NaCl 150 mM、CaCl2 5 mM、Tris-HCl 50 mM、pH 8.0) で 1:8 に希釈し、退色防止剤を添加します (Mounting Medium with Dapi H-1200、Vectashield 、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＬＴＤ、ケンブリッジシャー、英国）。 50 μL の蛍光ゼラチン混合物を各スラブの上に置き、カバースリップで覆います。 スライドは遮光し、37℃の加湿チャンバーでインキュベートします。 最適な潜伏期間を特定するために、蛍光画像を1時間から7日間撮影します。 共焦点顕微鏡による in situ ザイモグラフィーの 3D 解析の詳細な説明。 手短に言えば、内因性ゼラチン分解酵素活性の指標であるクエンチされたフルオレセイン結合ゼラチン基質の加水分解は、多光子共焦点顕微鏡 (ex: 488nm、および em: lp530nm; Zeiss、LSM 780、Carl Zeiss、Oberkochen) での検査によって評価されました。 、ドイツ）。 厚さ 85 μm の光学切片をさまざまな焦点面から取得し、積み重ねた画像を分析、定量化し、ZEN 2010 ソフトウェア (Carl Zeiss) で処理しました。

   3.4。 生体適合性の決定。 歯髄は抽出された小臼歯から得られ、接着性ナノコンポジットによる細胞生存率 (結果) または細胞損傷の分子マーカーが扱われます。

   歯髄は、Vaseemuddin66 によって説明されているように、抽出された小臼歯から得られます。 全 RNA が分離され、特定のアポトーシスおよびオートファジー マーカーの mRNA レベルは、前述のように qPCR によって測定されます (2.4.4-2.4.5)。

   3.5 機械的特性の評価 (結合の安定性 (結果) を評価するためのナノリークおよび次数変換分析) は、2.1 の方法と同等です。

4. 統計分析: SPSS 23.0 ソフトウェア (IBM、ニューヨーク、ニューヨーク、米国) を使用して統計分析を実行します。 2 つの独立したグループ間の量的変数 (マイクロ引張結合強度、ナノリーク、変換度、CFU のカウント) 間の比較は、対応のない t 検定、ANOVA、およびポットホック検定 (または Shapiro-Wilk によるそれぞれのノンパラメトリック検定) によって分析されます。データ分布のテスト)。 サンプル測定間の関連性は、ピアソンまたはスピアマンの相関によって計算されます。 検出力の計算は、以前の研究からのデータを使用して実行されました67。 Vildosolaらの研究64 (1 -β)。 p 値が次の場合、有意性が考慮されます。